长角血蜱Pmy蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

崔雪娇，张甜甜，曹园园，梁婷婷，胡永红

（河北师范大学生命科学学院，石家庄050024）

长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）在我国分布广泛，种群数量大，能够传播瑟氏泰勒虫（Theileria sergenti）、犬吉氏巴贝斯虫（Babesia gibsoni）等病原体，是人类健康和畜牧业生产的潜在威胁[1]，抗蜱疫苗是最有效的防治蜱类和蜱媒病的策略之一[2-3]，研制抗蜱疫苗关键是要筛选出一种能有效刺激宿主产生抗蜱能力的抗原，即保护性抗原.

副肌球蛋白（paramyosin，Pmy）是大多数无脊椎动物肌细胞中粗肌丝的主要成分，单体相对分子质量约为97 kDa（1kDa=1 000摩尔质量），其结构为杆状，中间为α-螺旋结构[4].研究表明，Pmy有显著的免疫原性，可作为疫苗候选抗原，已在血吸虫、线虫和绦虫等寄生虫防治研究中报道[5-7].而蜱类仅有微小扇头蜱（Rhipicephalusmicroplus）和肩突硬蜱（Ixodesscapularis）中报道过该蛋白的序列及理化特征[8]，有关Pmy表达条件优化的研究尚未见报道.本研究在前期成功构建长角血蜱Pmy表达载体的基础上，将重组质粒pET-32（a+）-pmy转入大肠杆菌E.coli BL21中，通过改变诱导时间、诱导温度及IPTG浓度，探究Pmy蛋白原核表达的最优条件，为进一步研制抗蜱疫苗奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

含有 pET-32（a+）-pmy的 E.coli BL21 菌种，由河北师范大学动物生理生化与分子生物学实验室构建并保存.

LB培养基：10 mg/mL蛋白胨、5 mg/mL酵母提取物、10 mg/mLNaCl，pH 为 7.2.

蛋白胨、酵母提取物和氨苄青霉素（Amp）均为国产分析纯（北京索莱宝科技有限公司）；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）（上海翊圣生物科技有限公司）；蛋白marker（Fermentas公司）.

高速冷冻离心机（Thermo公司）；电泳槽（BIORAD公司）；恒温培养箱（培英公司）；凝胶成像仪（Alpha Innotech公司）；－80℃超低温冰箱（Thermo公司）；脱色摇床（南京新校园生物研究所）.

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化、扩培和表达

菌种活化：将本实验室保存的含有质粒pET-32（a+）-pmy的菌液按体积比为1∶100的比例接种于5 mL的LB（含100μg/mL的 Amp）液体培养基中，37℃、200 r/min振荡培养过夜.

菌种扩培：取过夜培养的菌液，按体积比为1∶100的比例接种于LB（含100μg/mL的Amp）液体培养基中，37℃、200 r/min振荡培养.

诱导表达：当菌液OD600为0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为 0.5 mmol/L，在不同温度（18、25、30 和37 ℃）、不同时间（2、4、6、8和 12h）下诱导重组蛋白的表达，并分别收集菌液，10 000 r/min下离心10 min，收集菌体进行SDS-PAGE电泳检测，以确定重组蛋白的最佳表达条件.

在获得最佳诱导温度和时间后，向菌液中分别加入不同浓度的 IPTG（0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol/L），通过SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达量，以确定最适的IPTG诱导浓度.

1.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳

采用SDS-PAGE电泳，浓缩胶（pH为6.8）和分离胶（pH为8.8）的质量分数分别为5%和12%.电极缓冲液均为Tris-甘氨酸缓冲液（pH为8.3），含质量分数为0.1%的SDS.上样量为每孔20μL，以溴酚蓝为指示剂.当指示剂在浓缩胶中时，选用等压80 V电泳，待样品进入分离胶后调节电压到120 V.电泳在4℃冰箱中进行，当溴酚蓝移动到胶底部时停止电泳，迅速进行固定染色.

1.2.3 凝胶的染色和脱色

将凝胶放入考马斯亮蓝R-250染色液中染色30 min，用蒸馏水漂洗后，置脱色液（体积分数分别为10%的甲醇、10%的冰醋酸和80%的蒸馏水）中脱色，更换脱色液直至凝胶背景呈现清亮为止.凝胶染色和脱色均放置于脱色摇床上，以使染色和脱色均匀.

2 结果与分析

2.1 诱导温度对Pm y重组蛋白表达的影响

设定诱导时间为6h，诱导温度分别为18、25、30和37℃，同时在37℃条件下，以不含重组质粒的菌种作对照，不同温度下IPTG诱导Pmy重组蛋白（rPmy）表达的SDS-PAGE电泳结果如图1所示.

图1 不同温度下诱导重组蛋白表达的SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of recombination protein expression at different tem peratures

由图1可以看出，第5道对照组菌种不含Pmy重组质粒，因此120 kDa处未表达重组蛋白rPmy.而第1道至第4道菌种含Pmy重组质粒，在120 kDa处检测到rPmy表达.随着温度的升高，rPmy表达量随之升高.在37℃条件下，rPmy的表达量达到最大.这说明37℃时菌种繁殖最快，蛋白表达量最多.

2.2 诱导时间对Pm y重组蛋白表达的影响

选用0.5 mmol/L的IPTG、37℃条件下诱导rPmy的表达，诱导时间分别设置为 2、4、6、8和 12h；同时以第1道中不含重组质粒的菌种诱导6h作对照.SDS-PAGE电泳结果如图2所示.

图2 不同诱导时间下重组蛋白表达的SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of recombination protein expression in different induction time

由图2可以看出，对照组菌种不含Pmy重组质粒，因此未检测到rPmy.2～6道含Pmy重组质粒的菌种中均检测到rPmy的表达.随着诱导时间的增加，rPmy表达量随之升高，在诱导8h时，rPmy表达量达到最大，而诱导12h后，rPmy表达量降低.因此，在其他条件相同的情况下，诱导8h为重组表达的最佳诱导时间.

2.3 IPTG浓度对Pm y重组蛋白表达的影响

设定诱导温度为37℃、诱导时间为6h，IPTG的浓度分别设置为 1.0、0.8、0.6、0.4 和 0.2 mmol/L，观察IPTG浓度对Pmy重组蛋白表达的影响，SDS-PAGE电泳结果如图3所示.

图3 不同IPTG浓度条件下重组蛋白表达的SDS-PAGE电泳图Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of recombination protein expression with different IPTG concentration

由图3可以看出，IPTG浓度分别为1.0、0.8、0.6和0.4 mmol/L时，rPmy表达量无明显差异，均较高；IPTG浓度为0.2 mmol/L时，rPmy的表达量最低.考虑到IPTG的用量，在其他条件相同的条件下，IPTG最适浓度为0.4 mmol/L.

3 结论

对于本研究的原核载体而言，37℃，诱导8h，IPTG浓度大于0.2 mmol/L时，长角血蜱Pmy蛋白表达量较高.

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