鹅喉羚的死亡原因分析及致病菌的鉴定

刘 燕 ，郑常明 ，李伟杰 ，杨明海 ，李林海 ，李 莹 ，崔多英 ，张成林

（1.北京动物园，北京100044；2.圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京100044；3.中国兽医药品监察所，北京100081；4.北京自然博物馆，北京100050）

化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes），原称化脓棒状杆菌（Corynebacterium pyogenes）、化脓放线菌（Actinomyces pyogenes），1997年根据其 16S rRNA 的基因序列结果定名为化脓隐秘杆菌，将其归入隐秘杆菌属（Arcanobacterium）.该菌是圈养动物常见的一种条件致病菌，多发现于牛、羊、猪的黏膜上，可引起脓肿、伤口感染、菌血症等[1].近年来，在圈养野生食草动物，如林麝、斑羚、岩羊等的脏器脓肿中，也常分离到该致病菌[2-4].

16S rRNA基因扩增及测序技术多用于细菌的鉴定与分类[5-6]，该基因长度约1 500 bp，存在于所有原核生物基因组中，由多个保守区和相间的多个可变区组成，不同种细菌之间的可变区存在一定差异，即具有种属特异性[7].当16S rRNA基因序列的同源性小于97%时，通常被认为属于不同的种；当序列的同源性小于93%～95%时，通常认为应归于不同的属[8].

鹅喉羚是我国二级保护动物，世界自然保护联盟（IUCN）易危物种，目前发现4个亚种，分别是蒙古亚种、柴达木亚种、准葛尔亚种和叶尔羌亚种.鹅喉羚属于典型的荒漠、半荒漠动物，分布于我国新疆、青海、内蒙古西部和甘肃等地，尚未发现野外种群.国内多家动物园有圈养种群，北京动物园饲养鹅喉羚的历史悠久.本研究中发病的是北京动物园于2013年5月份繁殖的1只雄性鹅喉羚，曾注射过口蹄疫疫苗.在2015年1月份时发现右后肢趾关节肿胀，经治疗痊愈，2015年2月2日早上发现死亡.为确定其病因，课题组对该病死鹅喉羚进行尸检，并测定病原菌的16S rRNA基因序列，分析其与相似菌株的亲缘关系.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

细菌鉴定仪（上海复星佰珞有限公司）；脱纤维羊血、营养琼脂培养基（北京陆桥生物技术有限公司）；细菌DNA提取试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒、DNA聚合酶、dNTP、MgCl2和DNA Marker等（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）.

1.2 病原菌分离鉴定

鹅喉羚死亡后立即剖检，发现脓肿后，取脓液划线接种于脱纤维羊血琼脂平板，置于37℃恒温箱培养24h，观察细菌生长情况及菌落特征.纯化后进行触酶实验，并接种于细菌鉴定平板进行菌株鉴定.

1.3 16Sr RNA基因的扩增及测序

16S rRNA引物合成、PCR扩增及测序均由上海美吉生物技术有限公司完成.

1.4 测序比对结果

通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Blast对分离得到的菌株的16S rRNA基因序列进行同源性分析，将其与从北京动物园斑羚和岩羊分离到的化脓隐秘杆菌以及从GenBank数据库中获得的6个相关序列的菌株构建系统进化树.

2 研究结果

2.1 鹅喉羚死亡原因分析

对死亡的鹅喉羚进行剖检，发现心肌和右肺间叶有粘连并形成较大脓肿（1.5 cm×1.5 cm）.心肌有较明显的出血斑；肝脏有土黄色坏死斑，肿大，质脆；脾脏边缘有明显出血斑；肾上腺肿大出血，肾脏肿大充血，紫红色，皮髓质界线不清；膀胱黏膜暗红色，尿液深褐色，分别在肝脏左腹侧面和肠系膜上发现了4只囊尾蚴.初步判定该脓肿是造成鹅喉羚死亡的重要原因.

2.2 病原菌鉴定结果

对死亡鹅喉羚脓肿的脓液进行划线分离培养，发现该菌在血琼脂平板上生长缓慢，菌落较细小，有狭窄β溶血环，革兰氏染色呈阳性多形性球杆菌，如图1所示，触酶阴性.菌株鉴定结果显示，99%的细菌为化脓隐秘杆菌，命名为菌株1507.

图1 菌株1507的纯培养（×1 000）Fig.1 Pure culture of No.1507

2.3 16Sr RNA基因的扩增

用质量分数为1%的琼脂糖凝胶对扩增的PCR产物进行电泳，恒定电压100 V，维持30 min.通过凝胶成像系统观察电泳结果，确认扩增产物是约1 500 bp的DNA片段，符合预期.目的片段回收，送上海美吉生物公司测序后，得到1 434 bp的序列.

2.4 同源性分析与进化树构建

将得到的序列上传至GenBank数据库，与数据库中的多株化脓隐秘杆菌进行比对，发现同源性超过98%.用Mega 6.0软件通过UPGMA法进行系统发育树的构建，结果如图2所示.

图2 菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic treeof the strain

由图2可以看出，菌株1507与化脓隐秘杆菌GQ202628、JN578108、EU268194同属 1个分支，置信度超过99%.而与隐秘杆菌属其他菌株的同源性较差.结合微生物鉴定仪鉴定结果，可以确定此次引起鹅喉羚肺脏和心脏脓肿的是1株化脓隐秘杆菌.

3 结论

本研究对病死鹅喉羚进行尸检和菌种的分离鉴定，得到1株革兰氏染色呈阳性的多形性球杆菌.根据菌株的生物特性、微生物鉴定仪鉴定结果及16S rRNA基因序列比对结果，共同判断引起鹅喉羚心肌和右肺大块脓肿的是1株化脓隐秘杆菌.将菌株的16S rRNA序列提交至GenBank数据库，获得序列号为KP872907.

[1]王居海，张海波，周玉龙，等.犊牛化脓隐秘杆菌性肺炎的病原鉴定[J].畜牧与兽医，2010，42（9）：85-89.

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[3]唐婕，李斐然，刘文华，等.林麝肺部大肠杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染的诊断[J].畜牧与兽医，2014，46（7）：94-96.

[4]赵克雷，李旭鑫，帕哈尔定·帕拉哈提，等.圈养林麝脓肿病病原菌分离鉴定及药敏分析[J].四川动物，2011，30（4）：522-526.

[5]朱诗应，戚中田.16S rDNA扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用[J].微生物与感染，2013，8（2）：104-109.

[6]SONTAKKE S，CADENASM B ，MAGGI R G，et al．Use of broad range16S rDNA PCR in clinical microbiology[J].JMicrobiol Methods，2009，76（3）：217-225.

[7]PETTI C A．Detection and identification of microorganisms by gene amplification and sequencing[J].Clin Infect Dis，2007，44（8）：1108-1114.

[8]STACKEBRABDTE，GOEBELBM.Taxonomic note：aplace for DNARNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present speciesdefinition in bacteriology[J].Int JSyst Bacteriol，1994，44（6）：842-849.