RNA靶向基因组编辑技术CRISPR/Cas9在昆虫中的研究进展

张婷婷 ，柳伟伟 ，b，李 涛 ，张 敏 ，张学尧 ，马恩波 ，张建珍

（山西大学a.应用生物学研究所，b.生命科学学院，太原 030006）

基因组编辑技术是近年来发展最快的分子生物学和细胞生物学技术之一.CRISPR/Cas9系统是RNA介导的基因组编辑系统，由导向RNA（Single guide RNA，sgRNA）与靶标基因的DNA片段匹配，指导Cas9蛋白对基因组序列进行识别和切割，进而对靶标基因进行编辑.相对于锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），CRISPR/Cas9系统构建方法简单，打靶效率高，易于操作，日益受到基因编辑相关研究人员的广泛关注.

1 CRISPR/Cas9技术简介

1.1 CRISPR/Cas9系统的结构

CRISPR全称为成簇规律间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），这是一类广泛分布于细菌和古细菌基因组中的重复结构，是细菌对外源DNA（噬菌体等）入侵建立的获得性免疫系统.CRISPR由一系列短重复片段（Repeat序列）和不同的外源DNA序列间隔（Spacer）排列组成，其位点数量及中间的重复序列数量在不同物种间存在差异，该间隔序列与噬菌体/质粒的序列同源，从而为宿主细胞对抗外源感染提供了可能.Cas基因是CRISPR位点的保守相关基因（CRISPR-associated genes，Cas genes），是细菌获得免疫防御的基本元件，其蛋白能够切割核酸的功能结构域，可依据位点特异性将入侵生物DNA片段进行切割，如图1所示.

图1 细菌获得性免疫原理图[1]Fig.1 Diagram of princip leof acquired immune in bacteria

外源基因首次进入细菌中时，CRISPR系统会识别外源基因中带有的原型间隔序列毗邻基序（Protospacer adjacent motif，PAM）（NGG）序列，并将其上游约30 nt的序列剪切后插入CRISPR的2个Repeat中形成新的Spacer，从而获得免疫记忆.当外源基因再次进入细菌时，CRISPR在前导序列（Leader）的作用下起始转录，转录得到的前体RNA（Pre-crRNA）在相关核酸酶的作用下被剪切成小的含有Spacer的发夹RNA（crRNA）.crRNA与相关Cas蛋白可共同识别Spacer对应的外源基因序列，并实现对外源DNA的切割，以发挥免疫功能[1].

1.2 CRISPR/Cas9的作用机制

目前，在细菌中已发现3种不同类型的CRISPR/Cas系统，其中第2型的组成较为简单，由Cas9蛋白及导向RNA组成，这一类型被科学家们高度关注并尝试应用于多种生物的基因组修饰.在该系统中，Cas9蛋白由1 049个氨基酸组成，含有RuvC-like和HNH结构域，能够分别切割靶序列的2条链.crRNA结构中的Spacer序列位于5’端，Repeat序列位于3’端，其中Repeat序列能够与tracrRNA的部分序列相互匹配，形成新的嵌合体导向RNA，该RNA介导Cas9蛋白与靶基因的识别和切割.核酸酶结构域可以切割与crRNA互补配对的模板链，切割位点位于PAM上游3 nt处，RuvC-1ike结构域可以对另一条链进行切割，切割位点位于PAM上游3～8 nt处，如图2所示[2].研究发现，将crRNA与tracrRNA用1个CAAA的Loop环连接后融合表达（sgRNA），该系统仍能发挥切割功能[3]，并具有对细菌、酵母和哺乳动物等多种生物基因组的切割活性.

图2 CRISPR/Cas9基因组编辑机理[4]Fig.2 Mechanism of CRISPR/Cas9 genomeediting technology

CRISPR/Cas9技术对基因组的定向编辑是通过在基因组特定位置上造成双链断裂（doublestrand breaks，DSBs），控制DNA修复途径，对基因组定点修饰来实现的.一般来说，基因组DNA在受到损伤，形成双链切口DSBs后，机体会通过3种机制对DNA进行修复，即非同源重组末端连接（non-homologousend joining，NHEJ）修复、同源重组（homologous recombination，HR）修复和单链退火（singlestrand annealing，SSA）修复，原理如图3所示.

图3 DSBs介导的基因组修复原理图Fig.3 Pathway of gene repairs mediated by DSBs

NHEJ主要发生在细胞周期的G1期，将断裂的双链DNA直接连接而进行修复，可引起DSBs附近产生碱基变换、插入或者缺失（indels）；HR则发生在细胞周期的G2和S期，供体DNA（Donor）通过同源臂的作用进行精确修复；SSA修复常引起重复单元被删除，这是因为其发生DSBs的位置附近有较长的重复序列，经核酸外切酶加工所形成的单链末端依据碱基互补配对原则连接而修复.若CRISPR/Cas9系统所造成的DSBs位置在功能基因的外显子处，则通过NHEJ与SSA修复方式可造成该功能基因失活；此时若引入连接有该基因同源臂的候选基因或者筛选基因（Neo/puro）序列作为供体，则可在DSBs处通过HR修复，将筛选基因（Neo/puro）或者候选基因序列插入至功能基因的指定位点，实现在失活功能基因的同时引入新的候选基因，可用于基因缺失细胞系的筛选或者物种自身基因及外源新候选基因的功能研究.

1.3 CRISPR/Cas9技术的效率及脱靶效应的影响因素

CRISPR/Cas9技术依靠sgRNA对PAM区上游20 nt靶序列的识别，在PAM上游3 nt处进行切割，进而实现对基因组的定点修饰.因此影响该技术效率的因素主要有PAM序列的组成、sgRNA的组成及结构、物种、细胞类型以及筛选方式等.

PAM序列主要决定靶位点的位置及切割效率.最初报道在细胞水平上PAM序列为NGG时该系统的切割效率最高[4]，而对酵母的研究[5]发现，PAM序列为NGNGG时，能显著提高CRISPR/Cas9的特异性和切割效率.

sgRNA与靶位点区结合的序列、长度和结构是CRISPR/Cas9靶向特异性的保证.靠近PAM序列的8～14 nt的区域是保持其特异性的关键[3，6-7]，其余序列也在不同程度上影响脱靶效应.sgRNA缩短为17 nt，切割效率未明显下降，但可有效降低脱靶效应[8]，增加sgRNA识别序列的长度也可降低CRISPR/Cas9系统的脱靶效应，提高其特异性，但对切割效率稍有影响[9].Xu 等[5]从嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）基因组中克隆得到Cas9全长基因，建立了Cas9和引导RNA（gRNA）的酵母和哺乳动物细胞载体及报告系统，并对gRNA不同组成元件，包括靶位点序列长度（Target Length）、匹配区长度（Repeat Length）、茎环结构（Loop）和tracrRNA长度及靶位点序列中PAM的碱基组成进行系统优化，优化后的CRISPR/Cas9核酸酶系统获得更高的切割效率.该研究2014年被加拿大医药研究资讯公司Global Medical Discovery收录为Key scientific article.

CRISPR/Cas9系统在不同物种、不同细胞类型及修复方式下，其基因编辑效率存在差异[10].Ren等[11]建立了哺乳动物细胞水平surrogate reporter检测系统，经过FACs或puro筛选，以NHEJ和SSA介导为手段检测CRISPR/Cas9介导的基因修复效率，发现该筛选系统能将修复效率提高34倍.Maruyama等[12]发现将抗肿瘤因子Scr7加入到CRISPR/Cas9体系中，可抑制DNA ligase IV的活性，降低DSBs修复时NHEJ的效率，从而在哺乳动物细胞水平将HR的修复效率提高19倍.针对不同的应用目的，可根据物种和细胞品系类型，对Cas9蛋白进行优化，并对sgRNA和PAM序列及结构进行适当优化，建立相应的筛选系统，可提高基因编辑效率.

2 CRISPR/Cas9技术在昆虫学研究中的应用

CRISPR/Cas9技术已经在人类细胞[13]、大鼠Rat[14]、小鼠 murine[15]、斑马鱼 zebrafish[16]、牛 bovine[17]、羊 goat[18]、线虫（Caenorhabditis elegans）[19]等生物中成熟应用，但在昆虫中该技术仅在果蝇、家蚕和埃及伊蚊等的研究中有报道.

2013年初，Gratz等[20]率先使用CRISPR/Cas9技术对果蝇的Yellow及Rosy基因实现定点敲除，并进行多位点编辑、长片段删除与同源重组修复.同年6月，Bassett等[21]通过在果蝇syncytial blastoderm-stage的胚胎中注射Cas9 mRNA和sgRNA的复合物，针对Yellow基因获得了88%的编辑效率，得到稳定的遗传突变性状，并利用HRMA技术对基因编辑效率及脱靶效应进行了检测.同年7月，Yu等[22]同样利用CRISPR/Cas9技术对果蝇进行基因组编辑，通过Yellow基因等7个位点的验证，实现该技术在染色体上进行基因敲除和片段插入.同年9月，Kondo等[23]构建了生殖细胞特异性表达Cas9的转基因果蝇品系与表达sgRNA的果蝇品系，二者杂交后代为特异性基因敲除品系，为CRISPR/Cas9系统在果蝇中的应用提供了新的途径.2013年10月，Wang等[24]在家蚕中建立了CRISPR/Cas9系统，通过在家蚕卵期注射Cas9的mRNA与sgRNA混合物，成功敲除家蚕BmBLOS2基因，实现了“油蚕”表型.2014年，Liu等[25]报道在家蚕细胞中利用CRISPR/Cas9系统可同时实现6个基因的敲除；同时在家蚕个体敲除Bm702基因并在该位点实现外源基因插入[26].Wei等[27]在家蚕卵中注射Cas9 mRNA和sgRNA，可对Bm-ok、BmKMO、BmTH和Bmtan进行基因编辑，获得的Bm-ok基因敲除家蚕品系通过与野生型或者嵌合体自交，在子一代分别获得28.6%和93.6%的双等位基因敲除个体.2014年，多个课题组利用CRISPR/Cas9系统对果蝇进行基因插入、基因激活及抑制表达的研究[28-30]，为该技术在基因功能研究中的进一步应用提供了新的思路.Kistler等[31]在埃及伊蚊产卵后的3h内注射sgRNA与Cas9重组蛋白混合物，敲除基因Wtrw并引入带有stop位点的ssODN供体片段；通过CRISPR/Cas9系统对靶标基因DNA进行切割，形成DSBs，通过HR修复，在埃及伊蚊内插入ECFP阅读框，其后代可在荧光显微镜下显示蓝色以便于观察.尽管定向基因组编辑技术已经在上述昆虫中成功应用，但对于种类庞杂的昆虫类群来说，还需要科研工作者进行多种尝试，实现该技术在多种昆虫类型中的应用，为进一步研究基因功能提供新的技术手段.

定向基因组编辑技术，如ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9，在不同物种中使用时均需要满足一些必要条件：如基因序列及结构已知，有可稳定遗传的细胞系或原代细胞分离技术，成熟的受精卵注射技术及孵化技术等.昆虫是自然界中物种数量最多的类群，基因组结构复杂，测序难度大，遗传背景多样，受精卵注射及体外孵化条件建立困难.因此，在不同昆虫中应用基因组编辑技术建立突变品系及进行基因功能研究难度很大.但是，已有一些科学家经过不懈的努力，利用ZFNs和TALENs技术成功地对蟋蟀Lac2基因进行基因编辑，为基因组编辑技术在不同昆虫中的应用提供了新的思路和技术手段[32].

飞蝗为世界性农业害虫，也是典型的渐变态类昆虫.近年来，以飞蝗基因组测序完成为契机，探索害虫防治新型分子靶标成为研究热点.虽然飞蝗对RNA干预（RNAi）敏感，笔者所在团队前期已经利用RNAi技术对几丁质代谢酶家族基因进行干扰，并对10个相关基因的功能进行了初步研究[33-36].但发现RNAi干扰在特定时期（如卵期）、特定系统（如生殖系统）或特定基因（如一些转录因子）中存在沉默效率低的问题，无法对所有感兴趣的靶标基因进行功能研究.CRISPR/Cas9技术能在基因组水平对靶标基因进行敲除或者修饰，将有可能成为飞蝗基因功能研究的新工具.康乐院士课题组对庞大的飞蝗基因组序列进行测序和解析，发现飞蝗基因组结构较为复杂，拥有大量的重复序列，包含大量的DNA转座子和重复序列LINE反座子，造成基因组异常庞大，其基因组图谱约为6.5 Gb，是果蝇基因组大小的30余倍，约为人类基因组的2倍多，是迄今为止已知的最大的动物基因组[37].这一成果为利用CRISPR/Cas9技术对飞蝗基因组进行操作提供了可能.在此基础上，结合EST和转录组数据库，采用Race反应获得全长cDNA序列，进一步通过设计合适引物，结合Genome-walking可从基因组DNA扩增获得部分基因组序列，与cDNA序列比对后，即可知其内含子与外显子的位置，进而设计与靶标基因相应的sgRNA序列.同时本课题组成功建立了离体培养的飞蝗胚胎细胞系及外源基因转染技术，可结合CRISPR/Cas9技术在细胞水平对靶标基因功能进行初步验证，为后续在活体水平研究提供基础数据，以期完成对害虫靶标基因的筛选和验证，从而为飞蝗绿色防控提供新的技术手段.

3 技术展望

CRISPR/Cas9技术是近年来发展最快的基因组编辑技术之一，因其操作简单、成本低、可实现多个基因的同时操作，大部分分子生物学和细胞生物学实验室均可建立该技术体系，因此在未来的基因组编辑及基因功能研究中具有重要的应用价值.

对CRISPR/Cas9系统进行适当改造，将为基因功能研究提供新的思路和技术手段.Cas9n系统可将Cas9蛋白的第10位氨基酸由D转换为A，使其只切割靶位点的单链，Cas9n可在每个sgRNA结合点造成单链切口，2个相邻的单链切口则形成1个DNA双链断裂，如此就能实现NHEJ介导的基因编辑，这大大提高了CRISPR/Cas9系统的特异性，并降低其脱靶效率.而dCas9系统将Cas9蛋白失活，通过偶联不同的辅助功能蛋白，如FokI等，可实现更为精确的基因组切割和编辑，若为转录激活域（VP16或VP64），则可在体内对靶基因进行激活.若在其后连接甲基化酶，调控靶位点的甲基化水平，可用于表观遗传学研究.CRISPRi通过对靶位点的识别，可逆地对转录延伸和RNA聚合酶的结合进行阻滞，进而对靶标基因进行沉默[4].Konermann等[38]通过对CRISPR系统进行改造，在活细胞中可有效激活任何基因，用于对人类细胞中全基因组的功能基因筛选和特定疾病的基因鉴定.这些具有基因编辑、基因激活、抑制以及调控功能的CRISPR/Cas9家族成员，将为未来基因功能研究、调控、害虫防治乃至基因治疗等方面提供新型技术手段和研究思路.

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