八宝粥软罐头中一种致腐微生物的分离鉴定

何义，朱景松，姜旋，苑宁，张伟

（河北农业大学，河北保定071000）

八宝粥软罐头中一种致腐微生物的分离鉴定

何义，朱景松，姜旋，苑宁，张伟*

（河北农业大学，河北保定071000）

从胀袋的八宝粥软罐头中分离出一株致腐细菌zjs001，对其进行形态观察、革兰氏染色和API 20E生化鉴定，同时提取其基因组DNA，进行16SrDNA PCR扩增，对扩增产物进行测序，与NCBI中已知序列进行比对，以确定其种属，研究结果表明，引起八宝粥胀袋的腐败菌为阴沟肠杆菌。

八宝粥；软罐头；致腐菌；鉴定

八宝粥是中国传统食品，历史悠久，销量大且广泛。八宝粥由糯米、香米、莲子、大枣、花生、红豆、绿豆、银耳、白糖等多种原料制成［1］，具有健脾益胃、清热润肺、安神补肾的作用，并且含有丰富的营养素，易于消化吸收，深受广大消费者的喜爱。

八宝粥软罐头采用了新型的包装形式［2］，由蒸煮袋［3］等包装材料代替了以往的易拉罐，具有成本低、携带方便、营养损失少等优点［4］。但由于包装材料、杀菌技术及经验不足，导致八宝粥软罐头稳定性较差，在贮存过程中易被微生物污染，大大降低了产品的保质期［5-9］。目前，关于八宝粥的研究多集中于配方和工艺的优化［10］，八宝粥致腐微生物的研究鲜有报道。为此，本试验以胀袋后的八宝粥软罐头为研究对象，对其中的腐败菌进行了分离鉴定，确定了腐败菌的分类，为八宝粥软罐头的安全生产、品质控制、防腐保鲜提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料、试剂

材料：腐败变质的八宝粥软罐头。

试剂：革兰氏染色液：杭州百思生物技术有限公司；引物合成：华大基因；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×扩增缓冲液（含Mg2+）、胶回收试剂盒：宝生物工程（大连）有限公司；API试剂条：法国梅里埃公司。

培养基：YEPD琼脂、营养琼脂、营养肉汤、LB肉汤。

1.2方法

1.2.1保温试验和密封试验

将厂家随机抽取的100袋八宝粥样品放在37℃的温箱中培养7 d，观察是否有胀袋现象。将胀袋的粥样放入水浴锅内，然后慢慢升高水的温度至90℃左右，观察此过程中是否有连续气泡冒出，如果没有，表明袋密封完好。

1.2.2腐败菌的分离、纯化

采用无菌操作方法取胀袋的粥样20g放入锥形瓶中混合，加入20mL的无菌蒸馏水，此即含菌的原液，然后采用梯度稀释的方法，取0.1 mL菌悬液分别涂布于营养琼脂和YEPD平板，分别在36℃和28℃培养。然后挑取单菌落纯化3次，镜检，按菌落形态和镜检结果进行分离纯化，分别采用斜面保藏和液体石蜡密封保存。

1.2.3菌种的生化鉴定

1.2.3.1菌体形态鉴定

挑取试管斜面保存的菌种，稀释到10～8，涂布于营养琼脂平板上，37℃培养24 h～48 h，观察菌落特征，挑取单个菌落进行革兰氏染色及镜检。

1.2.3.2API细菌生化鉴定

通过革兰氏染色和氧化酶试验结果确定采用API试纸条的类型，测定操作与结果判断按API法要求进行。根据生化反应结果进行编码，从API 20E V3.2数据库中查找此编码可鉴定菌种。

1.2.416SrDNA分子生物学鉴定

1.2.4.1引物的设计与合成

根据文献报道，设计16SrDNA通用引物：上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’；下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。送华大基因合成。

1.2.4.2基因组DNA的提取

采用热裂解法提取分离菌株的基因组DNA，并经过电泳检测确认。

1.2.4.316SrDNA序列PCR扩增

PCR反应体系和PCR程序如表1和表2所示。

表1　PCR反应体系Table 1The PCR reaction system

表2　PCR程序Table 2The PCR program

1.2.4.4电泳检测

PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，DNAMarker为DL2000，凝胶成像观察拍照。

1.2.4.5PCR扩增产物回收及序列测定

PCR扩增产物经电泳确认后，用试剂盒回收DNA条带，送华大基因测序。根据测序得到的基因序列在NCBI上进行Blast比对，查找同源性大于或等于99%的菌种，用MEGA4软件进行多序列同源性分析，构建系统发育树。

2结果与分析

2.1保温试验和密封试验

100袋八宝粥样品在保温试验中只有一袋出现了膨胀现象。气密性检测显示各袋密封性良好，未出现漏袋现象。粥样简单染色镜检结果：大量短杆状细菌，单个或成对排列，未发现酵母菌和真菌。结果如表3所示。

表3　结果报告单Table 3The results report

2.2腐败菌的分离、纯化

按“1.2.2”方法从营养琼脂平板上筛选出1株腐败细菌，YEPD平板上未发现酵母菌和真菌。将这株细菌在营养琼脂平板上反复纯化培养后，斜面保存备用。2.3菌种的生化鉴定

2.3.1菌体形态鉴定

腐败菌的菌落及菌体形态见图1。

图1　腐败菌的菌落形态和菌体形态Fig.1Colony Morphology and Microscopic Morphology

菌落形态（如图1中a所示）：圆形，有凸起，边缘整齐，大而湿润，黏稠，乳白色，不透明。

镜检菌体形态（如图1中b所示）：革兰氏染色为阴性（红色），粗短杆菌，单个或成对排列，无芽孢。

2.3.2API细菌生化鉴定

通过革兰氏染色和氧化酶试验结果（阴性）确定采用API试纸条的类型为API20E。观察API20E试剂条颜色反应，进行结果判断，如表4所示。

表4　API结果表Table 4Result of API

根据生化反应结果进行编码，形成一个7位数字数码：3305563，从API 20E V3.2数据库中查找此编码，初步鉴定为阴沟肠杆菌，%ID为96.4≥90.0，T值为0.38≥0.25，为好的鉴定结果。

2.3.316SrDNA分子生物学鉴定

16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16SrR NA）的基因，长度约为1 500 bp，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子化石”。将本菌株命名为zjs001，16SrDNA目的基因片段PCR扩增结果如图2所示。

图2　菌液PCR产物电泳图Fig.2Electrophoresis for bacterium fluid PCR products

电泳验证结果在1 500 bp左右处出现了亮色条带，由此可以判断扩增产物是菌株zjs001的16S rDNA。切胶后用胶回收试剂盒回收目的DNA，经测序后，菌株zjs001的16SrDNA全序列碱基长度为1 384 bp。在NCBI上进行Blast比对，选择同源性高的菌株（≥99%）用MEGA4软件进行多序列同源性分析，zjs001与Enterobacter cloacae（阴沟肠杆菌）JQ308592的同源性最高，为99.4%，与API细菌鉴定系统鉴定结果相符，可鉴定为阴沟肠杆菌。用MEGA4软件进行多序列同源性分析，构建系统发育树（如图3所示），但系统发育进化树显示zjs001独立为一小分支，也有为一新种或亚种的可能性，还有待进一步研究。

图3　菌株zjs001的16SrDNA序列的系统发育进化树Fig.3Phylogenetic tree based on the 16SrDNA seguences of strain zjs001

3讨论与结论

八宝粥由8种粮谷物组成，每种都有其特定的微生物滋生，所以引起八宝粥食品腐败的微生物种类繁多，其丰富的营养，为微生物的繁殖提供了条件和良好的生长环境。据前人研究知，细菌、霉菌、酵母等都可以引起八宝粥食品的腐败。霉菌、酵母菌对高温的抵抗力差，一般的高温加热就可以使霉菌、酵母菌致死，引起这两种类型菌污染的原因是加热不足或加热不均匀，食品的某些部位没有达到预想的温度，出现了微生物的残留，造成了食品的变质，本论文从胀袋的八宝粥中分离到一株主要腐败细菌，通过形态观察、革兰氏染色、API 20E生化鉴定和16SrDNA分子测序方法的鉴定结果为阴沟肠杆菌，说明阴沟肠杆菌能导致该种八宝粥软罐头食品腐败，其污染可能是由于加热不均匀所致，在大批量的生产中只有少数出现腐败问题，可见严格按照规范生产操作至关重要。

微生物的鉴定方法很多，目前比较经典的是生理生化试验和分子生物学鉴定相结合的方法。生理生化试验对不同代谢产物、代谢酶系统的检测对细菌进行鉴定。分子生物学是现代发展比较迅速和前沿的学科，根据四种核苷酸的排列顺序可以对细菌进行鉴定。16SrDNA具有高度保守的序列，在生物的演变史中几乎没有发生变化，可利用保守区将细菌16SrDNA扩增出来，根据非保守区区分种属。又由于16SrDNA大小适中，约1 500 bp大小的长度，对其测序相对容易，所以16SrDNA称为鉴定细菌的首选。

［1］闫亚梅，户长润.软罐头八宝粥的研制［J］.山东食品发酵，1995（3）: 15-17

［2］侯婷.浅谈软罐头［J］.消费导刊，2009（19）:2

［3］汤文杰.浅谈蒸煮袋应用状况［J］.今日印刷，2008（4）:20-21

［4］郑海平，申利娟.碗装八宝粥稳定性的影响因素研究［J］.食品工业，2012，33（5）:54-56

［5］Put HM，Van Doren H，Warner WR，et al.The mechanism of microbiological leaker spoilage of canned foods:a review［J］.Appl Bacterial，1972，35（1）:7-27

［6］杜红利，刘畅.罐头制品腐败变质的原因及检测方法［J］.江苏食品与发酵，2008（3）:24-26

［7］张秀丽.罐头食品的常见败坏类型［J］.现代农村科技，2011（23）:74

［8］廖建龙.罐藏食品腐败变质的原因及对策［J］.福建农业科技，2013（11）:68-69

［9］陈忠杰，李存法，王璐.引起罐藏食品腐败变质的微生物探讨［J］.郑州牧业工程高等专科学校学报，2012，32（1）:19-21

［10］夏金丹，曹玉敏，孙玉敬.常见八宝粥的蛋白质优化研究［J］.中国食品学报，2014，14（1）:162-170

Separation and Identification Spoilage Microorganisms in the Soft Can of Rice Pudding

HE Yi，ZHU Jing-song，JIANG Xuan，YUAN Ning，ZHANG Wei*
（Agricultural Univorsity of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China）

A strain of pathogenic Microbal zjs001 was successfully isolated from the spoilage of one soft can of rice pudding，by morphological observation.Gram staining and biochemical characterization of 20E API were performed，and the genomic DNA wasextracted，and PCR 16SrDNA was amplified and sequenced.The amplified products were sequenced and compared with the known sequences in NCBI，identified as Enterobacter cloacae.

rice porridge；soft can；rot fungus；identification

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.036

2015-08-17

何义（1979—），男（汉），助理研究员，硕士，研究方向：食品科学。

张伟（1963—），男，教授，研究方向：食品科学。