长白山松子降血压肽制备工艺优化

吴丹，刘春雷，闵伟红，*

（1．吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春130118）

长白山松子降血压肽制备工艺优化

吴丹1，2，刘春雷1，2，闵伟红1，2，*

（1．吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春130118）

采用碱性蛋白酶对长白山松子分离蛋白进行酶解，以水解度和酶解物的ACE抑制率为考察指标，考察酶解pH、酶解温度、底物浓度、加酶量4个因素的影响，通过响应面（Box-Benhnken）组合优化试验，确定得到ACE抑制率最佳的条件为酶解pH8.9，酶解温度55℃，加酶量7 500 U/g（以底物计），底物浓度2.5%，此时ACE抑制率为70.1%，水解度为17.5%，与模型预测值基本相符。

长白山松子；降血压肽；ACE；抑制率

松子（Pinus konaiensis Sieb.et Zucc.）属松科松属植物，是一种经济价值很高的药食同源物质［1］。国内松子主要分为两种，东北松子和巴西松子。现已研究松子蛋白质含量89%左右，含有17氨基酸，其中8种必需氨基酸满足FAO/WHO规定的成人推荐值［2-3］。

植物蛋白酶解后释放出活性多肽［4］，降血压肽（Antihypertension Pepfide）又称血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽，是酶解蛋白质产生的一类具有抑制血管紧张素转换酶活性的多肽物质。一般含2～14个氨基酸。不同来源的降血压肽，其相对分子质量大小和氨基酸组成不完全相同［5］。ACE抑制肽最早是Ferreira在1965年从美洲茅头短蛇毒中发现的，随后又从蛇毒中获得了多种氨基酸的抑制肽［6］。源于食品的降血压肽是一类能够降低人体血压的小分子多肽的总称［7］。这些肽类食用安全性高，对血压正常人群无降压作用，易消化吸收，具有促进细胞增殖、提高毛细血管通透性等作用，且无副作用，可用作降压功能性食品或药物基料，已成为目前研究的热点［8］。

目前少见对长白山松子降血压肽研究的报道，本试验以松子分离蛋白为原料，利用酶控制水解技术，通过响应面试验组合确定制备长白山松子降血压肽的最佳酶解条件，为长白山松子降血压肽的理论研究和进一步的产品开发提供理论参考。

1材料与仪器

1.1材料

松子分离蛋白（蛋白含量89.69%）：实验室自制。血管紧张素转化酶（0.25UN）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）：购于sigma公司；Alcalase 2.4L FG：Novozymes公司；磷酸二氢钠，乙酸乙酯等均为国产分析纯。

1.2仪器

FD-1B-50型冷冻干燥机：北京博医康仪器有限公司；Z36HK型高速冷冻离心机：德国HERMLE公司；FE20型pH计：瑞士梅特勒-托利多集团；UV-1700型紫外可见分光光度计：日本岛津；SartoriusRSA224S型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司等。

1.3试验方法

1.3.1水解度（DH）测定

采用pH-stat法［9］。

1.3.2测定ACE抑制率

运用紫外分光光度计测定［10-11］。

1.3.3酶解松子分离蛋白响应面法优化试验

采用响应曲面法的中心组合设计，以抑制率为指标对酶解条件进行优化。依据前期试验结果确定4个因素的水平编码如表1所示。根据试验数据进行回归拟合建立回归模型。

表1　因素水平表Table 1Table of factor level

2结果与分析

2.1模型建立与分析

利用Design-Expert软件，通过试验数据进行多元回归拟合见表2。

表2　Box-Behnken设计方案及试验结果Table 2Design and results of Box-Behnken

续表2Box-Behnken设计方案及试验结果Continue table 2Design and results of Box-Behnken

得到回归方程为：抑制率=69.68-0.43A-0.73B+ 0.93C+9.68D-2.25AB-7.65AC-4.75AD-8.75 BC-0.35BD+5.42CD-9.04A2-13.07B2-5.01 C2-10.43D2

对抑制率方差分析结果见表3所示。

表3　回归模型方差分析表Table 3Variance analysis of experimental results

所建立的二次回归模型是极显著的（Prob＜0.01），P值于越小，相应参数的显著性越明显［12］。失拟项0.125 5大于0.05，差异不显著，说明其他因素对试验结果干扰较小，模型与试验值结果拟合较好，具有代表性；同时回归方程的复相关系数R2=0.904 9，说明90.49%可变动性可以用该响应面模型解释，可以利用该回归方程对酶解工艺进行分析和预测［13］。根据回归模型方程中各因素回归系数绝对值大小，可知各因素影响抑制率的顺序：底物浓度＞加酶量＞温度＞pH。

2.2响应面分析及优化

根据回归方程，作出响应面，考察拟合响应曲面的形状见图1。

图1　各因素交互作用对抑制率影响的三维曲面图Fig.1Response surface of mutual influence on the reducing power ability

分析4个因素对酶解产物ACE抑制率的影响。最大值是由椭圆轮廓图表面上突出处预测［14］。通过Design-Expert软件分析，得出酶解分离蛋白最佳工艺条件：pH8.9，温度55℃，加酶量7 500 U/g，底物浓度2.5%，此条件下验证，得到ACE抑制率为70.1%，水解度为17.5%，与模型预测值较为吻合。采用响应面法优化得到的酶解松子分离蛋白工艺条件比较可靠，具有一定的实用价值。

3结论

本试验用碱性蛋白酶解长白山松子分离蛋白得到降血压酶解产物，对pH、温度、加酶量、底物浓度以ACE抑制率为指标进行响应面优化，并建立了回归模型，方差分析表明拟合较好。优化后最佳工艺参数：pH值8.9，温度55℃，加酶量7 500 U/g，底物浓度2.5%，酶解时间3 h。在此条件下进行验证试验得到ACE抑制率为70.1%，水解度为17.5%，与响应面试验相符。本试验研究长白山松子降血压多肽，为今后研究松子多肽提供了理论依据和实验数据，为长白山松子降血压肽功能性食品的进一步开发利用提供参考。

［1］Faruk，Kubilay V.Some physical，mechanical and aerodynamic properties of pine（Pinus pinea）nuts［J］.Journal of Food Engineering，2005，68（2）:191-196

［2］Wu D，Min W H，Liu J S，et al.Functional Properties of the Protein Isolate and Major Fractions of Pine Nut Proteins Prepared from the Changbai Mountain in China［J］.AdvancedMaterialsResearch，2014，881-883:766-775

［3］Prakash A，Zhu X M.Scaled-up production of zero-trans margarine fat using pine nut oil and palm stearin［J］.Food Chemistry，2010，119（4）:1332-1338

［4］CárceL L M，Bon J，Acuña L，et al.Moisture dependence on mechanical properties of pine nuts from Pinus pinea L［J］.Journal ofFood Engineering，2012，110:294-297

［5］Alemán A，Gómez-Guillén M C，Montero P.Identification of aceinhibitory peptides from squid skin collagen after in vitro gastrointestinal digestion［J］.Food Research International，2013，54:790-795

［6］Zhang Y H，Olsen K，Grossi A，et al.Effect of pretreatment on enzymatic hydrolysis of bovine collagen and formation of ACE-inhibitory peptides［J］.Food Chemistry，2013，141:2343-2354

［7］Pan D D，Cao J X，Guo H Q.Studies on purification and the molecular mechanism of a novel ACE inhibitory peptide from whey protein hydrolysate［J］.Food Chemistry 2012，130:121-126

［8］Ra S Q，Sun J，Liu Y T，et al.ACE inhibitory peptides and antioxidant peptides derived from in vitro digestion hydrolysate of hen egg white lysozyme［J］.Food Chemistry，2012，135:1245-1252

［9］Adler-Nissen J.Enzymic hydrolysis of food proteins［M］.Elsevier Applied Science Publishers，1986

［10］Anna J，Monika K，Barbara B，et al.The impact of fermentation and in vitro digestion on formation angiotensin converting enzyme（ACE）inhibitory peptides from pea proteins［J］.Food Chemistry，2013，141: 3 774-3780

［11］Hwang J S.Impact of processing on stability of angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitory peptides obtained from tuna cooking juice［J］.Food Research International，2010，43:902-906

［12］Adinarayana K，Suren S.Response surface optimization of enzymatic hydrolysis of maize starch for higher glucose production［J］.Biochemical Engineering Journal 2005，27:179-190

［13］Junfan C，Desheng L，Shib B，et al.Optimization of hydrolysis conditions for the production of glucomanno-oligosaccharides from konjac using β-mannanase by response surface methodology［J］.Carbohydrate Polymers，2013，93:81-88

［14］Parmjit S P.Application of response surface methodology in the permeabilization of yeast cells for lactose hydrolysis［J］.Biochemical Engineering Journal，2008，39:91-96

Preparation and Optimization of Antihypertensive Peptides from Pinus koraiensis Sieb.et Zucc Nuts in Changbai Mountain

WU Dan1，2，LIU Chun-lei1，2，MIN Wei-hong1，2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing，Changchun 130118，Jilin，China）

Pinus koraiensis Sieb.et Zucc protein isolate was hydrolyzed with alcalase to prepare antihypertensive peptides.Operating parameters such as pH，temperature，substrate concentration and enzyme dosage were optimized using response surface analysis based on degree of hydrolysis and ACE inhibitory rate.The optimum hydrolysis conditions for ACE inhibitory rate（70.1%）and degree of hydrolysis（17.5%）were found to be hydrolysis at 55℃，pH 8.9 for 3 h with an enzyme/substrate ratio of 7 500 U/g and substrate concentration of 2.5%，with the model prediction.

Changbai Mountain pine nuts；antihypertensive peptides；ACE；inhibitory activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.024

2014-06-16

国家“863”计划项目（2013AA102206）

吴丹（1989—），女（蒙古），硕士研究生，研究方向：发酵工程。

闵伟红（1971—），女，教授，博士生导师，主要从事发酵工程、粮油科学与深加工技术研究。