桦褐孔菌抗氧化物质的提取工艺优化及其活性

李孝坤，马金菊，王浩，王振强，*

（1.黄河水利职业技术学院，河南开封475003；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

桦褐孔菌抗氧化物质的提取工艺优化及其活性

李孝坤1，马金菊1，王浩2，王振强1，*

（1.黄河水利职业技术学院，河南开封475003；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）

通过响应面分析对桦褐孔菌抗氧化活性成分的提取工艺进行了优化，并对提取物的铁离子还原能力（FRAP）、DPPH自由基清除能力进行了评价。结果表明，最佳提取工艺为料液比1∶20（g/mL），乙醇浓度65%，提取温度85℃，提取时间2.5 h。根据最佳提取工艺，得到桦褐孔菌抗氧化活性成分提取物得率为21.6%，其多酚含量为12.04 mg/g，铁离子还原能力测试（FRAP）值为1.42 mmol/g样品，提取物浓度为400 μg/mL时DPPH自由基清除率为78.05%。加热实验表明，桦褐孔菌提取物具有一定的热稳定性。

响应面法；桦褐孔菌；提取；抗氧化活性

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属，是一种生于桦树上的药用真菌，主要分布于中国北部（黑龙江和吉林长白山）、俄罗斯北部、日本北海道和北欧等地。民间广泛用于防治消化道疾病和肿瘤（胃癌、肠癌及肝癌等）、心血管疾病、糖尿病和抗病毒等［1-2］。大量研究表明，桦褐孔菌中含有三萜类［3］、多酚类［4］、黑色素［5］和多糖［6］等活性物质，具有很高的抗氧化活性［4-6］。通过响应面分析对桦褐孔菌抗氧化活性成分的提取工艺进行了优化，并对提取物的抗氧化活性进行了评价。

1材料与方法

1.1材料与试剂

三吡啶三吖嗪（tripyridyl triazine，TPTZ）、二苯代苦味肼基自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：购自Sigma公司；其余为国产分析纯或色谱纯试剂。

桦褐孔菌由吉林延边自治州延吉食用菌研究所提供，粉碎、备用。

1.2仪器设备

Uvmini-1240紫外可见分光光度计：日本岛津；干浴器：美国labnet；YP型电子天平：上海天平仪器厂；KQ5200DB型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LG16-W离心机：北京医用离心机厂。

1.3方法

1.3.1乙醇浓度对桦褐孔菌抗氧化物质提取的影响

准确称取10.00 g桦褐孔菌，按1∶20（g/mL）的料液比加入不同浓度的乙醇，80℃回流提取3次，每次1 h，合并提取液、减压浓缩、冷冻干燥，得粗提物干粉，于4℃冰箱中备用。

1.3.2不同料液比对提取物的得率的影响

65%乙醇不同料液比80℃回流提取3次，每次1 h，提取物经减压浓缩、冷冻干燥，得粗提物干粉。

1.3.3响应面分析优化

在单因素试验结果基础上选取乙醇浓度、提取时间和提取温度三因素进行响应面分析优化试验，以得率和总还原力为评价指标，其因素水平及结果如表3所示，重复3次。

1.3.4FRAP法总抗氧化能力的测定

采用Zoran Maksimovic等［7］方法，0.1 mL样液（500 μg/mL）同3.0 mL FRAP工作液（0.3 mol/L pH 3.6乙酸钠缓冲液、10 mmol/LTPTZ和20 mmol/L三氯化铁以体积比10∶1∶1混合）混均，37℃反应10 min，以1.0 mmol/L FeSO4·7H2O为标准做标准曲线，样品的抗氧化能力以mmol/g样品表示。

1.3.5DPPH自由基清除能力的测定

采用Cuendet等［8］方法，0.6 mL提取液（200 μg/mL～400 μg/mL）同3.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH甲醇溶液混均，于37℃反应30 min，517 nm比色。DPPH自由基抑制率采用以下方程式计算。

1.3.6总还原力的测定

按照Oyaizu等［9］方法，1.0 mL提取液（250 μg/mL）加入到2.5 mL磷酸缓冲液中（0.2 mol/L，pH 6.6），然后加2.5 mL 1%六氰合铁酸钾K3［Fe（CN）6］，50℃水浴30 min后加2.5 mL 10%三氯乙酸，混均后1 500 r/min离心10 min，上清液2.5 mL同2.5 mL水和0.5 mL 0.1%三氯化铁混均，700 nm比色测定，以OD700表示，吸光度值越大表示其还原力越强。

1.3.7提取物的热稳定性

准确量取提取物（1 mg/mL）10 mL于10 mL比色管中，在干浴器上分别于25、50、75、100℃条件加热，试验结束补水，维持浓度不变，通过测定其FRAP值的变化评价其热稳定性。

1.3.8多酚含量的测定［10-11］

取1 mL（1 mg/mL）样液加到10 mL比色管中，依次加入去离子水1 mL，福林-酚试液0.5 mL，26.7% Na2CO3溶液1.5 mL，然后用水定容至10 mL，在50℃水浴下保持10min，冷却，在760nm下测定其吸光度，求得试样中总酚的含量。以没食子酸为标准品（8 μg/mL～100 μg/mL）绘制标准曲线。

2结果与分析

2.1不同乙醇浓度提取物的提取率、多酚含量、FRAP值比较

不同乙醇浓度提取物经减压浓缩、冷冻干燥，粗提物得率、多酚含量和FRAP值见表1。

表1　桦褐孔菌不同浓度乙醇提取的得率、多酚含量和FRAP值Table 1The extraction yield、polyphenol concentration、FRAP value with different ethanol concentration from Inonotus obliquus

提取溶剂的差异对提取过程、产物成分、提取效率等具有重要影响。由表1可以看出，不同浓度乙醇对桦褐孔菌抗氧化成分提取效果有较大的差异，65%乙醇提取效果最好，其提取物得率、多酚含量、FRAP值分别达到21.62%、12.04 mg/g和1.42 mmol/g样品，其抗氧化能力高于其他浓度乙醇提取物。

2.2不同料液比对提取物得率的影响

65%乙醇按不同料液比回流提取，提取物经减压浓缩、冷冻干燥，粗提物得率见表2。

表2　不同料液比对得率的影响Table 2The extraction yield with different ratio of materials to solvent

提取溶液的增多有利于活性成分的充分溶出。由表2可以看出，当料液比由1∶10（g/mL）增大到1∶20（g/mL）时，提取物得率由14.86%增加为21.62%，此后再增大料液比，得率增加缓慢，因此，料液比选择1∶20（g/mL）。

2.3响应面分析优化

利用SAS 9.0软件，以得率（%）和总还原力OD700为评价指标，对乙醇浓度、温度和时间三因素进行分析，具体试验设计及结果见表3。

表3　响应面试验设计及结果Table 3The experiment design and results of response surface design

抗氧化物质得率（%）的响应面试验因素方差分析见表4。

表4　得率（%）的响应面试验因素方差分析Table 4Analysis of variance showed the effect of processing variables on the responses considered of Yield（%）

还原力OD700的响应面试验因素方差分析见表5。

回归方程如下：

表5　还原力OD700的响应面试验因素方差分析Table 5Analysis of variance showed the effect of processing variables on the responses considered of reducing power OD700

由表3及回归分析可得到最优提取条件为：乙醇浓度65%、提取温度85℃、提取时间2.5 h，模型预测提取物得率和总抗氧化力OD700分别为21.5%和0.685，在此条件下进行验证试验，得率和总抗氧化力OD700分别达到21.6%和0.692。由表4、表5可知，回归方程拟合度较好，能较好地反映试验各因素对得率和还原力的影响。根据回归方程，乙醇浓度（X1）、温度（X2）、时间（X3）对得率和总还原力OD700的响应面分析如图1、图2、图3所示。

图1　乙醇浓度和温度对得率和总抗氧化力OD700的优化曲线图Fig.1Contour optimizer plot of yield and total reducing power OD700，ethanol concentration（X1）and temperature（X2）

通过分析可知乙醇浓度（X1）对得率和总还原力OD700的影响趋势一致，65%乙醇的提取物得率和提取物的抗氧化活性都最高，明显优于55%和75%乙醇的提取效果。温度（X2）的增高和时间（X3）的延长有利于活性成分的溶出，但高温可能会造成提取物抗氧化成分的损失，从而造成其抗氧化活性的降低。

图2　乙醇浓度和时间对得率和总抗氧化力OD700的优化曲线图Fig.2Contour optimizer plot of yield and total reducing power OD700，ethanol concentration（X1）and time（X3）

图3　温度和时间对得率和总抗氧化力OD700的优化曲线图Fig.3Contour optimizer plot of yield and total reducing power OD700，temperature（X2）and time（X3）

2.3提取物的抗氧化活性研究

提取物的抗氧化活性如表6所示。

表6　提取物的DPPH清除能力Table 6DPPH radical scavenging percentage of extracts

桦褐孔菌抗氧化活性成分提取物具有较强的抗氧化能力，提取物浓度为400 μg/mL时DPPH自由基清除率达到78.05%。

2.4提取物的热稳定性

提取物（1 mg/mL）在干浴器中分别于25、50、75、 100℃条件下加热，其热稳定性如图4所示。

图4　提取物的FRAP热稳定性Fig.4Heating-stability of extracts to different temperature evaluated by FRAP

在前15 min，提取物在不同处理温度条件下的FRAP值未发生明显变化，即其铁离子还原能力未发生明显损失。100℃加热60 min和120 min其铁离子还原能力仍能保留78%和64%以上。

2.5提取物多酚含量与抗氧化活性的相关关系

桦褐孔菌不同乙醇浓度提取物的多酚含量与抗氧化活性的相关性关系如表7所示。

表7　多酚含量与FRAP值和DPPH自由基清除能力的相关性Table 7The correlation between the contents of polyphenol and FRAP value，DPPH radical scavenging percentage

多酚含量与FRAP值的相关性最高达到0.861 2，与DPPH自由基清除能力的相关性也达到了0.839 5，显示桦褐孔菌乙醇提取物中的多酚物质可能是其表现抗氧化活性的主要原因之一，这与Yong Cui［4］等的报道一致。

3结论

通过响应面分析对桦褐孔菌抗氧化活性成分的提取工艺进行了优化。结果表明，最佳提取工艺为料液比1∶20（g/mL），乙醇浓度65%，提取温度85℃，提取时间2.5 h，在此条件下得率为21.6%，多酚含量为12.04 mg/g。

提取物铁离子还原能力（FRAP）、DPPH自由基清除能力评价表明：桦褐孔菌提取物具有较强的抗氧化能力，铁离子还原能力测试（FRAP）值为1.42 mmol/g样品，提取物浓度为400 μg/mL时DPPH自由基清除率为78.05%。

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Optimization of Extraction of Antioxidants from Inonotus obliquus and Its Antioxidant Activities

LI Xiao-kun1，MA Jin-ju1，WANG Hao2，WANG Zhen-qiang1，*
（1.Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475003，Henan，China；2.Department of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The extracting technology of crude antioxidants from Inonotus obliquus was studied and response surface methodology（RSM）was applied to optimize the process.And antioxidant activities of extracts from Inonotus obliquus were evaluated by FRAP assay and DPPH radical scavenging capacity.The optimal extracting conditions were ratio of materials to solvent 1∶20（g/mL），concentration of ethanol 65%，extraction temperature 85℃and extraction time 2.5 h.Under these conditions，extraction yield of antioxidants was 21.6%，12.04 mg/g polyphenol could be obtained.The Inonotus obliquus extracts had a strong antioxidant activity，the FRAP value，DPPH radical scavenging capacity with a concentration of 400 μg/mL were 1.42 mmol/g sample（FeSO4·7H2O equivalents）and 78.05%，respectively.Characterization of the Inonotus obliquus extracts antioxidants proved that those antioxidants were heat-resistant.

response surface methodology（RSM）；Inonotus obliquus；extraction；antioxidant activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.013

2014-12-24

李孝坤（1982—），男（汉），讲师，硕士，主要从事化学检测分析教学与研究。

王振强（1979—），男（汉），讲师，硕士，主要从事食品检测分析教学与研究。