超声微波协同萃取法提取菊苣酸条件研究

王英超，王蕾，金红，*，李秋闯，杨孝丽

（1.天津农学院基础科学学院，天津300384；2.天津农学院农学与资源环境学院，天津300384）

超声微波协同萃取法提取菊苣酸条件研究

王英超1，王蕾2，金红2，*，李秋闯2，杨孝丽2

（1.天津农学院基础科学学院，天津300384；2.天津农学院农学与资源环境学院，天津300384）

利用超声微波协同萃取对紫锥菊中菊苣酸最佳提取条件进行研究。采用新鲜的紫锥菊根部，考察乙醇浓度、微波提取时间、微波提取功率、料液比等因素对紫锥菊中菊苣酸提取含量的影响，并采用正交试验优化提取条件。结果表明：浓度为50%乙醇、料液比1∶25 g/mL、微波提取时间660 s、微波提取功率300 W和提取次数为1次为最佳提取条件。在最佳提取条件下进行了3组平行验证试验，得到菊苣酸平均含量为158.4 μg/g。

紫锥菊；菊苣酸；超声微波协同萃取

紫锥菊（Echinacea purpurea）是原产于美洲的一类菊科野生花卉，也称“松果菊”［1］。全株具有很高的药用价值和观赏价值［2］。我国于20世纪70年代开始引入，已在北京、南京、上海等地引种成功。尽管引种时间短，但各行业对其的研究进展均较快［3］。菊苣酸是紫锥菊中极为重要的免疫活性成分之一，具有增强免疫功能和抗炎作用，并能抑制透明质酸酶，保护胶原蛋白免受可导致降解的自由基的影响［4］。菊苣酸的提取方法主要有：超声波法、聚酰胺法、相转移萃取法、正交实验法［5-8］。目前还没有利用超声-微波协同萃取紫锥菊中菊苣酸的研究报道。本工作以天津地区栽植的一年生紫锥菊植株为研究对象，通过超声微波协同萃取法萃取其中的有效成分—菊苣酸，并利用高效液相色谱法进行含量测定，为菊苣酸的提取方式提供新依据，也为天津地区药企栽植利用紫锥菊提供参考。

1材料与方法

1.1材料

紫锥菊：采自天津农学院基础科学学院生化实验室，常规肥水管理及病虫害防治，待生长至收获期，选取生长大小一致，无病害的紫锥菊根部作为试验材料。使用前对根部进行清洗备用。

1.2试剂

无水乙醇（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；0.1%冰醋酸（分析纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：天津市江天化工技术有限公司；菊苣酸标准品（纯度＞98%）：北京百灵威科技有限公司。

1.3仪器与设备

1200 Series Agilent高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；FA-2004电子天平：上海方瑞仪器有限公司；Milli-Q Advantage A10超纯水仪：美国密理博（中国）有限公司；CW-200超声-微波协同萃取仪：上海新拓分析仪器科技有限公司；Haier BCD-241WE/Y冰箱：青岛海尔股份有限公司。

1.4方法

1.4.1不同乙醇浓度对菊苣酸含量的影响

选取新鲜的紫锥菊根1 g，按料液比1∶25 g/mL的比例，分别加入20%乙醇、35%乙醇、50%乙醇、65%乙醇、80%乙醇、无水乙醇于各个萃取瓶中进行提取。程序如下：超声90 s，无微波功率；关掉超声，微波300 s、功率300 W。待反应结束后，过滤，滤液于4℃条件下12 000 r/min离心10 min。上清液过0.45 μm有机滤膜，滤出液作为高效液相色谱仪进样样品使用。以菊苣酸的含量（μg/g）为评价指标，探讨不同乙醇浓度对提取菊苣酸含量的影响。

菊苣酸的含量（μg/g）=样品中菊苣酸的含量（μg/ mL）×提取液总体积（mL）÷取样量（g）

1.4.2不同的料液比对提取菊苣酸含量的影响

选取新鲜的紫锥菊根1 g，按不同料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）加入不同体积的50%乙醇于各个萃取瓶中进行提取。程序如下：超声90 s，无微波功率；关掉超声，微波300 s、功率300 W。后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同的料液比对提取菊苣酸含量的影响。

1.4.3不同的微波萃取时间对提取菊苣酸含量的影响

选取新鲜的紫锥菊根1 g，按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL于各个萃取瓶中进行不同微波时间提取。程序如下：（1）超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波180s、功率300 W。（2）超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波300 s、功率300 W。（3）超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波420 s、功率300 W。（4）超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波540 s、功率300 W。（5）超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波660 s、功率300 W。后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同的微波提取时间对提取菊苣酸含量的影响。

1.4.4不同的微波功率对提取菊苣酸含量的影响

选取新鲜的紫锥菊根1 g，按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL于各个萃取瓶中进行不同微波功率（200、300、400、500、600 W）的提取。程序如下：（1）超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波540 s、功率200 W。（2）超声90s、无微波功率；关掉超声，微波540s、功率300 W。（3）超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波540 s、功率400 W。（4）超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波540 s、功率500 W。（5）超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波540 s、功率600 W。后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同的微波功率对提取菊苣酸含量的影响。

1.4.5不同的提取次数对提取菊苣酸含量的影响

选取新鲜的紫锥菊根1 g，按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL于萃取瓶中进行不同次数的提取。反应程序如下：超声90 s、无微波功率；关掉超声，微波540 s、功率300 W。提取一次后，将滤后的紫锥菊根吸干表面液体，继续按料液比1∶20 g/mL加入50%乙醇20 mL再次进行提取并重复上述过程。每次提取结束后均将滤液4℃下，12 000 r/min离心10 min。后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同的提取次数对提取菊苣酸含量的影响。

1.4.6高效液相色谱条件［9］

分离柱：XDB-C18（4.6×50 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈：0.1%冰醋酸=25∶75（体积比）；流动相速度：0.2 mL/min；检测器：紫外检测器，波长330 nm；柱温：40℃；进样体积：5 μL。

1.4.7菊苣酸标准曲线的制作

将1 mg/mL的菊苣酸标准品稀释成不同浓度，样品浓度为0.5、2.5、25、50、100 μg/mL。按照其上述色谱条件进行试验，以峰面积为纵坐标，菊苣酸的浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4.8正交试验

以单因素试验为基础，选择微波功率、时间和料液比三因素，进行三因素三水平正交试验设计。具体设计见表1。

表1　三因素三水平正交试验设计Table 1The design of three factors and three levels of orthogonal test

1.4.9数据统计分析

采用Excel软件进行数据分析。

2结果与分析

2.1菊苣酸标准曲线及标准品高效液相色谱图

菊苣酸标准曲线及标准品高效液相色谱图分别见图1和图2。

图1　菊苣酸标准曲线Fig.1The standard curve of cichoric acid

图2　菊苣酸标准品高效液相色谱图Fig.2HPLC chromatogram of cichoric acid

菊苣酸标准曲线图见图1，从图1可以看出，菊苣酸标准曲线方程：y=20.13x-28.359，R2=0.990 7，式中：y为峰面积，（mAU·s）；x为菊苣酸浓度，（μg/mL），可以看出方程线性关系明显。图2为菊苣酸标准品的高效液相色谱图。从图2可以看出，菊苣酸的出峰时间在3.524 min。

2.2不同乙醇浓度对提取菊苣酸含量的影响

不同乙醇浓度对菊苣酸提取含量的影响结果如图3所示。

图3　不同乙醇浓度对菊苣酸提取含量的影响Fig.3Effect of different concentration of ethanol on the content of cichoric acid extraction

从图3中可以看出，随着乙醇浓度的增加，菊苣酸的含量逐渐增大，当乙醇浓度为50%时，菊苣酸含量达到最大值229.8 μg/g。当乙醇浓度高于50%时，菊苣酸含量逐渐递减，最低值为12 μg/g。这可能与微波加热的机理有关，提高乙醇浓度可以增加提取剂对物料的渗透性，从而提高得率。但进行超声微波协同萃取时，主要是物料中的极性分子尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量使物料升温，乙醇浓度增加减小了料液中水的比例，使物料升温减慢从而影响得率［10-12］。因此选择50%乙醇作为提取溶剂。

2.3不同的料液比对菊苣酸提取含量的影响

不同料液比对菊苣酸提取含量的影响结果如图4所示。

图4　不同料液比对菊苣酸提取含量的影响Fig.4Effects of different ratio of material to liquid on the content of cichoric acid extraction

从图4可以看出，随着料液比的逐渐升高，提取的菊苣酸含量逐渐上升，当料液比为1∶20 g/mL时，菊苣酸含量达到最高，数值为171 μg/g。继续升高料液比，菊苣酸含量降低。当料液比为1∶15 g/mL时，菊苣酸含量为150 μg/g。其原因可能是提取溶剂对微波能量的吸收增大，导致细胞对微波能量吸收减少，细胞破裂不完全［12］，菊苣酸释放量少。所以选择1∶20 g/mL为最佳料液比。

2.4不同的微波提取时间对菊苣酸提取含量的影响

不同的微波提取时间对菊苣酸提取含量的影响如图5所示。

图5　不同微波萃取时间对菊苣酸提取含量的影响Fig.5Effects of different extraction time on the content of cichoric acid extraction

从图5中可以看出随着时间的增加，菊苣酸的含量也在逐渐增大。当提取时间达到540 s时，提取的菊苣酸含量最大，数值为115.9 μg/g。超过540 s后，菊苣酸含量呈下降趋势。可能是由于微波时间过长，部分菊苣酸被破坏，导致菊苣酸含量降低。所以微波萃取的最佳时间为540 s。

2.5不同的微波提取功率对菊苣酸提取含量的影响

不同的微波萃取功率对菊苣酸提取含量的影响如图6所示。

图6　不同微波提取功率对菊苣酸提取含量的影响Fig.6Effect of microwave power on the content of Cichoric Acid extraction

从图6可以看出，随着微波功率的增加，提取的菊苣酸的含量也在逐渐增加。在300 W时提取的菊苣酸含量达到最大值143.9 μg/g。超过300 W后，菊苣酸的含量明显下降。这是因为外加电场作用增强，分子热运动作用增大，得到菊苣酸的提取含量较高；随着功率继续增大，提取的菊苣酸容易发生变质，增加能耗。综合以上因素，所以选择300 W作为最佳微波提取功率。

2.6不同的提取次数对菊苣酸提取含量的影响

不同的提取次数对菊苣酸提取含量的影响的结果如图7所示。

图7　不同提取次数对菊苣酸含量的影响Fig.7Effect of extraction times on the content of Cichoric Acid extraction

从图7可以看出，在同一条件下，随着提取次数的增加，菊苣酸的含量逐渐降低，提取1次时，菊苣酸的含量115.9 μg/g，提取第2次时，菊苣酸含量为0 μg/g。说明提取1次可以将根部中的菊苣酸提取完全。故而选择提取1次为最佳提取次数。

2.7正交试验法优化试验

通过对单一因素的筛选，我们确定了两个因素水平：提取溶剂为50%乙醇，提取次数为一次。另外3个因素对菊苣酸含量影响较大，所以我们选择微波提取时间、微波功率和料液比3因素做正交试验。由极差分析可知，对菊苣酸含量的影响因素从大到小依次为料液比、提取时间、提取功率。说明料液比对菊苣酸含量的影响最大，是主要因素，其次是时间和功率。提取条件的优化组合为A2B3C3。由此确定最佳酶解条件为提取功率300 W、提取时间660 s和料液比1∶25 g/mL。该优化组合在上述9组试验并中出现。在此提取条件下进行3组平行验证试验，得出平均菊苣酸含量为158.4 μg/g。

表2　三因素三水平正交试验结果Table 2Results the three factors and three levels orthogonal experiment

3结论

菊苣酸最佳提取条件为50%乙醇、料液比1∶25 g/mL、微波提取时间660 s、微波提取功率300 W和提取次数为1次。在最佳提取条件下进行了3组平行验证试验，得到菊苣酸平均含量为158.4 μg/g。与传统提取方法相比，该方法具有简便、可靠、省时的优点。

［1］张莹，刘珂，吴立军．紫锥菊属药用植物研究进展［J］．中草药，2001，32（9）:852-855

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Study on Extraction Conditions of Ultrasonic Microwave Synergistic Extraction Method of Cichoric Acid

WANG Ying-chao1，WANG Lei2，JIN Hong2，*，LI Qiu-chuang2，YANG Xiao-li2
（1.College of Basic Science，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China；2.College of Agronomy and Resource Environment，Tianjin Agriculture University，Tianjin 300384，China）

Studing on optimum extraction conditions of cichoric acid from Echinacea purpurea with ultrasonic microwave extraction.Using the fresh Echinacea root，exploring the concentration of ethanol，extraction time，microwave power，ratio of material to liquid and other factors on the content of cichoric acid from Echinacea purpurea，and adopting the optimization extraction conditions by orthogonal test.The results showed that the concentration of 50%ethanol，solid-liquid ratio 1∶25 g/mL，microwave power 300 W，one times extraction and extraction times of 660 s as the best extraction conditions.Three groups of parallel test under the optimum condition were conducted，the average content of cichoric acid was 158.4 μg/g.

Echinacea purpurea；cichoric acid；ultrasonic microwave synergistic extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.008

2015-05-04

天津市大学生创新创业训练计划项目（201410061092）

王英超（1981—），女（汉），实验师，硕士，研究方向：生物化学实验教学与研究工作。

金红（1967—），女，教授，硕士，研究方向：生物化学教学与生物技术研究。