堆肥中高效纤维素降解菌的筛选与鉴定

李丹花等

摘要：从邯郸地区堆肥中分离出5株具有纤维素降解能力的菌株，纤维素降解能力的初步鉴定结果显示，M1菌株具有较强的纤维素降解能力。对M1菌株进行分子鉴定和生长特性的初步鉴定，结果表明，M1菌株应当归属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.），菌株的温度生长范围为10～45 °C，最适生长温度为30 °C，pH 6～8菌株均可生长，最适条件为pH 6。

关键词：土著菌；纤维素降解；假单胞菌属（Pseudomonas sp.）；生长特性

中图分类号：X705 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）16-3884-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.013

Isolation and Identification of Cellulolytic Bacteria for Composting

LI Dan-hua， QIAO Li-juan， YUE Dan，ZAN Li-feng， DUAN Bao-ning， BAI Lan-suo

（College of Biology Science and Project， Handan College， Handan 056005，Hebei， China）

Abstract：Five cellulolytic bacteria were isolated from composting of Handan region. Cellulose degradation ability was preliminarily measured. The results showed that strain M1 has strong ability of cellulose degradation. Molecular identification and growth characteristics then were identified. The results showed that strain M1 should belong to the Pseudomonas sp.Growth temperature ranged from 10 ℃ to 45 ℃. The optimum growth temperature was 30 ℃. The strain could grow under the pH value from 6 to 8， the optimum growth pH value was 6.

Key words：indigenous bacteria；cellulose degradation；Pseudomonas；growth characteristics

当前，农村环境污染日趋严重，尤其是农村生活垃圾、畜禽养殖废弃物及农作物秸秆等主要农村固体废弃物已成为污染农村环境的主要因素，影响着农村建设的进程。堆肥化处理技术是解决农村固体废弃物问题的一个重要途径，是目前使废弃物无害化、减量化和资源化的关键技术[1]。在高纤维含量的堆肥或者添加秸秆、木屑等调节剂[2]的堆肥处理中，其成分和结构复杂，难以被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用，已成为缩短堆肥周期、提高堆肥效率的限制性因素，因此，纤维素的生物降解成为堆肥技术处理有机固体废弃物的关键，一些研究者就堆肥纤维素分解菌进行了研究，筛选出很多高效的降解菌株[3，4]。

有研究表明，在堆肥过程中强化接种高效微生物菌株可以增加堆体中的微生物数量，利用微生物菌群间的相互协同作用促进堆肥材料的腐熟，提高堆肥效率，但是由于堆肥物料成分复杂，接种外源微生物菌株与堆肥土著微生物之间有时也存在竞争，致使二者均不能充分发挥其作用[5，6]。因此，如能将土著菌的高效菌株强化接种到堆肥中，将能更好地发挥微生物菌剂的作用，加快固体废弃物中有机物的分解，提高堆肥腐熟度。

本研究从邯郸地区堆肥中筛选到一株降解纤维素的高效土著菌，并对其进行分子鉴定，初步研究其生长特性，旨在为堆肥提供优良纤维素分解菌株，加快堆肥中纤维素的分解，以进一步优化堆肥进程。同时也为构建土著菌组成的高效微生物菌剂奠定基础[7]。

1 材料与方法

1.1 样品的采集和处理

猪粪堆肥样品采自邯郸市种猪场常年堆肥车间。取腐熟堆肥发酵物带回实验室。取腐熟发酵物1 g放入无菌锥形瓶中，加入9 mL蒸馏水稀释至0.1 g/mL，加入玻璃珠振荡培养1 h备用。

1.2 培养基配方

羧甲基纤维素钠培养基组分为：CMC-Na 10.00 g、KH2PO4 1.00 g、NaCl 0.10 g、MgSO4 ·7H2O 0.30 g、NaNO3 2.50 g、FeCl3 0.01 g、CaCl2 0.10 g、琼脂 18.00 g、蒸馏水1 L；刚果红纤维素琼脂培养基组分为：CMC-Na 10.00 g、KH2PO4 1.00 g、NaCl 0.10 g、MgSO4 ·7H2O 0.30 g、NaNO3 2.50 g、FeCl3 0.01g 、CaCl2 0.10 g、刚果红 0.20 g、琼脂 18.00 g、蒸馏水1 L；LB培养基组分：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。所有培养基于121 ℃下灭菌30 min备用。

1.3 菌种的分离纯化

发酵物菌液按照梯度稀释法稀释，取稀释度为10-2～10-5的悬浊液200 μL分别涂布于羧甲基纤维素钠分离培养基中培养，培养物放入28 ℃恒温箱培养，将长出的菌落接种至LB培养基上进行划线纯化。

1.4 分解纤维素能力鉴定

将纯化好的菌株点接到刚果红纤维素琼脂培养基上，28 ℃恒温箱培养5 d，量取透明圈直径（D）和菌圈直径（d），并计算出比值HC（D/d），从而判定菌株的纤维素分解能力。

1.5 菌株的分子鉴定

用细菌DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取细菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，27F和1 492R为16S rDNA引物进行分子鉴定。PCR产物琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）回收大约1.5 kb的目的条带，连接到pGM-T载体（北京索莱宝科技有限公司）上，转化至E. coli DH5α感受态细胞中，将阳性重组子送北京擎科新业生物技术有限公司测序。将测定得到的16S rDNA序列通过BLAST软件与GenBank中相关序列进行比对，并利用MEGA 5.0软件进行聚类分析构建进化树。

1.6 不同温度对菌株M1生长的影响

将M1菌株的菌液以1%的接种量接种于5 mL LB培养基中，分别培养于10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55和60 ℃系列摇床内，摇床转速为100 r/min，2 d后测定菌株的生长量。每个处理重复3次。

1.7 不同pH对菌株M1生长的影响

将M1菌株的菌液以1%的接种量分别接种于pH 2.0、4.0、6.0和8.0的5 mL LB培养基中，置于30 ℃、100 r/min 的摇床上培养，2 d后测定菌株的生长量。每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 菌株分解纤维素能力鉴定

腐熟发酵物样品经羧甲基纤维素钠培养基分离培养和LB培养基划线纯化培养后共得到5株形态不同的菌株，分别命名为M1-M5。5株菌都可以在羧甲基纤维素钠培养基上生长，具有降解纤维素的能力。同时测定菌株在刚果红纤维素琼脂培养基中生长时的HC值（D/d），对筛选到的菌种进行分解纤维素能力的初步鉴定，结果如表1所示。

M1-M5菌株的HC值表明，M1菌株的HC值最高。前人研究表明[4]，HC值超过2.50的菌株纤维素酶活性高，M1菌株的HC值为2.50，具有较强的纤维素降解能力。

2.2 菌株鉴定结果

将菌株M1的16S rDNA测序结果用BLAST软件进行同源性比较，菌株M1的系统发育树如图1所示。结果表明，M1菌株序列与多个假单胞菌属（Pseudomonas sp.）菌株的16S rDNA序列相似性都达到99%，与Pseudomonas sp. JC5菌株处在同一个分支上，因此，将菌株M1归属于Pseudomonas sp.。

2.3 M1菌株生长特性

M1菌株生长特性如图2所示，由图2可知，菌株的温度生长范围为10～45 ℃，最适生长温度在30 ℃左右，当温度高于45 ℃时，菌株几乎不能生长。pH 6～8条件下菌株均可生长，最适条件为pH 6，pH<4或pH>10，菌株均不能生长。

3 小结与讨论

本试验从腐熟堆肥发酵物中筛选到5株形态不同的菌株。分别命名为M1-M5。5株菌都可以在羧甲基纤维素钠培养基上生长，具有降解纤维素的能力。同时测定菌株在刚果红纤维素琼脂培养基中生长时的HC值，M1菌株的HC值最高（2.50），具有较强的纤维素降解能力。

对菌株M1进行分子鉴定，结果表明，M1菌株序列与多个假单胞菌属菌株的16S rDNA序列相似性都达到99%，与Pseudomonas sp. JC5菌株处在同一个分支上，因此，将菌株M1归属于Pseudomonas sp.。对假单胞菌属菌株降解性能的研究多集中于降解有毒有害物质[8]，如降解蛋白质、淀粉及脂肪等[9]，但对该属中纤维素降解菌的研究较少，因此，该菌在菌株综合应用中具有较大的潜力。

初步测定菌株M1的生长特性，结果表明，菌株的温度生长范围为10～45 ℃，最适生长温度为30 ℃，高于45 ℃时菌株几乎不能生长，可以据此判定此菌为中温型细菌。pH 6～8条件下菌株均可生长，最适条件为pH 6，pH<4或pH>10时菌株均不能生长。

本研究着眼于筛选邯郸地区堆肥中具有较高纤维素降解能力的土著菌，并对高效的土著菌菌株进行分子鉴定和生长特性的初步鉴定。此研究为具有高效纤维素降解能力的土著菌的堆肥应用提供理论基础和实践依据，具有较大的应用潜力。同时为制备高效的新型微生物菌剂奠定基础。

参考文献：

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[4] 王志超，陆文静，王洪涛.好氧堆肥中高温纤维素分解菌的筛选及性状研究[J].北京大学学报（自然科学版），2006，42（2）：259-264.

[5] 席北斗，孟 伟，刘洪亮，等.三阶段控温堆肥过程中接种复合微生物菌群的变化规律研究[J].环境科学，2003，24（2）：152-155.

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[9] GROUDIEVA T， KAMBOUROVA M，YUSEF H， et al. Diversity and cold-active hydrolyticenzymes of culturable bacteria associated with arctic sea ice， Spitzbergen[J]. Extremophiles， 2004，8： 475-488.