碳纳米管对粳稻愈伤组织分化影响的研究

刘清岱　刘素华　马小倩等

摘要：采用粳稻辽粳294愈伤组织进行分化诱导试验，研究碳纳米管对粳稻愈伤组织分化和幼苗及根生长的影响。结果表明，添加浓度为10 μg/mL碳纳米管的分化培养基，其粳稻愈伤组织出绿率为80%，成苗率达40%，明显高于不加碳纳米管的对照；当碳纳米管浓度为50 μg/mL时，成苗率及苗长较10 μg/mL处理时降低，但仍高于对照。说明一定浓度的碳纳米管可以促进粳稻愈伤组织分化及出苗和根系的生长。

关键词：粳稻；碳纳米管；愈伤组织分化；根系生长

中图分类号：S512.2+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）19-4851-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.051

Absarct： The experiment of callus induction and differentiation of japonica rice Liaojing 294 was carried out to explore the effects of carbon nanotubes on japonica rice callus differentiation and seedling and root growth. The results showed that the callus differentiation and root growth were both promoted by carbon nanotubes at the concentration of 10 μg/mL， with the green rate and seedling emergence rate increasing to 80% and 40% respectively； and at the concentration of 50 μg/mL， the seedling emergence rate and seedlings length decreased compared with those at the concentration of 10 μg/mL， but were slightly higher than the control. It indicated that carbon nanotubes could promote the japonica rice callus germination and root growth at low concentration， while may have inhibition effects at high concentration.

Key words： japonica rice； carbon nanotubes； japonica rice callus differentiation； root growth

水稻（Oryza sativa L.）作为一种重要的粮食作物和模式生物，已被广泛深入地研究，但是由于水稻自身的遗传特性，其在组织培养过程中再生效率较低，极大地影响了水稻遗传改良的进程，并限制了对其自身生长发育过程及机理的研究[1]。水稻遗传转化体系的研究一直受到广泛的关注，其遗传转化体系需要高效的外植体脱分化诱导和植株再生技术，自1965年中国开展水稻组织培养的研究以来[2]，用于水稻再生体系的外植体有成熟胚、幼穗、幼胚、花药等[3]。与其他外植体相比，成熟胚具有取材不受生长季节限制、再生周期短、再生植株育性好、灭菌容易、外植体均匀、重复性好等优点，因此成熟胚的愈伤组织是一种较理想的适合于水稻遗传转化的再分化体系[4，5]。

碳纳米管是由碳原子组成的同轴纳米管，直径一般为1～20 nm，而长度在微米级。碳纳米管具备良好的生物相容性，因此在生物科学领域中的应用备受瞩目[6，7]。2009年Khodakovskaya等[8]利用碳纳米管促进种子发芽和生长，并且率先提出了纳米农业的概念。当前，纳米科学与农业科学不断交叉与融合，催生了纳米农业科学等新兴学科，为农业科技创新提供了新的科学理论与方法。本试验以粳稻辽粳294成熟胚为材料，在分化培养基中加入碳纳米管，研究碳纳米管对粳稻愈伤组织分化的影响，探索优化粳稻愈伤组织分化的新技术，旨在为实现高效的遗传转化体系提供新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

所用材料为粳稻辽粳294成熟胚，由天津天隆农业科技有限公司提供。

单壁碳纳米管规格：外径<2 nm，长度30 μm，纯度>95%，灰分<1.5%，比表面积>500 m2/g，电导率>100 s/m，购自中国科学院成都有机化学有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 粳稻愈伤组织的诱导 选取饱满的成熟粳稻种子，手工剥去颖壳，在超净工作台内，先用去离子水冲洗去表面尘土，然后用75%乙醇处理90 s，去离子水冲洗3遍，再用0.1%升汞处理15 min，最后再用去离子水冲洗3次，干燥之后接种于诱导培养基（MS+1 mg/mL 2，4-D+1 mg/mL KT）上，在24～26 ℃条件下进行暗培养，诱导愈伤组织形成。

1.2.2 配置碳纳米管悬浮液 称取10 mg的碳纳米管于灭菌的1.5 mL离心管中，随后加入去离子水990 μL。盖好离心管盖，置离心管于超声波清洗机中100 W超声2 h。最终的超声时间随悬浮状态确定，一般应至少保持纳米材料均匀悬浮10 min以上。

1.2.3 粳稻愈伤组织的分化培养 配制10 mg/mL的碳纳米管悬浮液并稀释到不同浓度，然后在含有分化培养基（MS+1 mg/mL 6-BA+1 mg/mL NAA） 的培养瓶中加入不同浓度的（0、10、50 μg/mL）碳纳米管悬浮液。待诱导培养基冷却凝固后尽量挑选表面光滑、湿润度高、颜色较白的愈伤组织接种于分化培养基上，培养条件为温度25 ℃、光照时间14 h/d、光照度1 500～2 000 lx。endprint

1.2.4 粳稻愈伤组织的继代培养 在粳稻愈伤组织分化至30 d左右时，将没有褐化的愈伤组织继代到新的与原来浓度相同的分化培养基中。

1.2.5 观察和结果的记录 接种后对愈伤组织的分化情况进行定期观察，每5 d观察一次，记录愈伤组织的分化情况，15 d之后将分化出的幼苗定期取出进行测量，并在30 d后对其根长进行测量。

2 结果与分析

2.1 碳纳米管对粳稻愈伤组织分化的影响

辽粳294是辽宁省稻作研究所育成的优质水稻新品种，具有分蘖力强、抗倒伏性强、米质优良等特性。辽粳294接种到诱导培养基上3 d后胚根开始萌发，4～5 d时开始长出1～2 mm黄色颗粒状愈伤组织，之后粳稻愈伤组织增殖速度明显加快，10 d时愈伤组织表面结构比较紧密，表面平滑，呈现淡黄色。11～12 d时愈伤组织长至约3 cm后将其接种到分化培养基中，结果发现粳稻愈伤组织在分化培养基上培养5 d之后开始出现绿色生长点，各分化培养基中愈伤组织的出绿情况见表1。由表1可知，不加碳纳米管的分化培养基愈伤组织的出绿率为60%，但含有碳纳米管的分化培养基中愈伤组织的出绿率达80%，出绿率明显高于对照，说明碳纳米管对愈伤组织的分化有促进作用。

随着粳稻愈伤组织培养时间的增加，愈伤组织的出绿率不断增大。观察表明添加了不同浓度碳纳米管的培养基中愈伤组织出现绿点的时间及个数各不相同，其结果见表2。由表2可知，不加碳纳米管的分化培养基粳稻愈伤组织在6 d之后出现绿点，而添加了碳纳米管的分化培养基愈伤组织在3 d后就开始形成绿点，加快了粳稻愈伤组织的分化过程，同时15 d后平均每5块愈伤组织出现绿点总数为13～15个，而对照只有9个。但同一时间内，碳纳米管浓度为50 μg/mL的培养基中愈伤组织出现的绿点数较浓度为10 μg/mL的绿点数略少，说明可能由于碳纳米管浓度升高，开始出现减缓愈伤组织分化的情况。

2.2 碳纳米管对粳稻幼苗生长发育的影响

由表3可知，对照粳稻愈伤组织分化至15 d左右之后，绿点开始形成小苗，成苗率为25%，而添加了碳纳米管的培养基中愈伤组织幼苗生长发育明显加快，成苗率达38%～40%，可以看出添加了碳纳米管的培养基平均每5块愈伤组织的出苗数和成苗率都明显高于对照组。

在粳稻愈伤组织分化至30 d左右时，由于原来培养瓶中的营养成分几乎用尽需要进行继代，若不继代容易出现褐化现象，时间过长会使已经出现绿点的愈伤组织也不能继续分化成苗。所以继代时将出现绿点和绿苗的愈伤组织继代到新的与原来培养基浓度相同的培养基上，已经褐化的愈伤组织不进行继代。继代后并继续定期观察，并记录苗高，结果见表4。由表4可知，同一碳纳米管浓度下，随着培养时间的延长，幼苗平均高度增加；而在同一时间内，碳纳米管浓度为10 μg/mL的处理辽粳294幼苗生长状况最好，其次是碳纳米管浓度为50 μg/mL的处理。

2.3 碳纳米管对粳稻根系生长的影响

粳稻的愈伤组织经过30 d分化后，碳纳米管浓度为10和50 μg/mL处理的粳稻幼苗根生长情况与不含碳纳米管的对照相比，根系长势良好。碳纳米管浓度为10 μg/mL共培育的粳稻愈伤组织根长为2.05 cm，长势最好，其次是碳纳米管浓度为50 μg/mL的处理，根长为1.28 cm，而不含碳纳米管的对照根长为1.05 cm，差异较明显。

3 小结与讨论

水稻愈伤组织的绿苗再生一直是遗传转化工作最关注的问题，许多水稻品种的转化率很低，在很大程度上是由于分化率的影响，因此研究如何提高愈伤组织绿苗再生频率是现在水稻工作者的研究重点[9]。现在粳稻的组织培养技术已经很成熟，愈伤组织诱导较容易，生长速度快，再生效率高，许多品种已经建立了基于愈伤组织的重复性好、转化率高的遗传转化体系[10]。

申聪香[11]的研究发现碳纳米管能够穿透完整植物细胞壁和细胞膜进入到细胞当中以完成分子的传送，而本试验结果同样表明，碳纳米管对粳稻愈伤组织具有生长调节作用，分化培养基中添加浓度为10～50 μg/mL碳纳米管可促进粳稻愈伤组织的分化和幼苗的生长，促进根系生长。碳纳米管浓度在10 μg/mL时对愈伤组织的促进效果最好，其机理可能是碳纳米管所具有的一些理化性质使其能够穿透粳稻愈伤组织，使愈伤组织内部的大分子团裂成小分子团，在同一空间下，分子团运动速度增加，提高了分子团相互碰撞的几率，从而使活性增强，并且碳纳米管的存在导致水分吸收加强，使得愈伤组织有更高的发芽率和生物量，适当浓度的碳纳米管还可能调节植物内部新陈代谢，增加抗逆性，促进根系生长。但本试验也发现碳纳米管浓度为50 μg/mL时，粳稻的苗高和根长比碳纳米管浓度为10 μg/mL处理时要短，说明碳纳米管浓度过高可能对植物的生长产生副作用，但其机理尚需进一步的探讨。提高粳稻愈伤组织的增殖、分化及生根的具体机制目前还不清楚，有待于进一步的研究。

参考文献：

[1] 武美燕，蒿若超，田小海，等.添加纳米碳缓释肥料对超级杂交稻产量和氮肥利用率的影响[J].杂交水稻，2010，25（4）：86-90.

[2] 林 艺.水稻组织培养的研究进展及存在问题[J].安徽农学通报，2010，16（1）：78-79.

[3] 袁云香，张 莹.水稻组织培养的研究进展[J].江苏农业科学，2010（1）：83-86.

[4] 王 芳，王 嫘，张 军，等.高留胚率水稻辽粳294成熟胚组织培养条件的优化[J].湖北农业科学，2012，51（5）：1033-1036.

[5] 蒋 苏，马鸿翔，魏 芳，等.NAA或潮霉素对小麦成熟胚愈伤组织分化的影响[J].分子植物育种，2012，10（1）：35-41.

[6] 王志伟，刘清岱，荆 玮，等.纳米碳粉和碳管对大肠杆菌抗紫外伤害的研究[J].安徽农业科学，38（15）：8170-8171.

[7] 刘清岱，王金菊，王 勇.纳米粒子PCR研究进展[J].生物学通报，2010，46（4）：359-364.

[8] KHODAKOVSKAYA M， DERVISHI E， MAHMOOD M. Carbon nanotubes are able to penetrate plant seed coat and dramatically affect seed germination and plant growth[J]. AACS Nano，2009，3（10）： 3221-3227.

[9] 王北艳，向殿军，殷奎德.提高粳稻成熟胚抗性愈伤再生频率的研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（1）：28-31.

[10] 廖鹏飞，赵君幸，雷发扬，等.不同基本培养基和激素对籼稻成熟胚愈伤组织诱导的影响[J].湖北农业科学，2012，51（18）：4121-4125.

[11] 申聪香.碳纳米管对植物细胞影响的生物细胞学分析[D].广州：中山大学，2010.endprint