骨水泥对兔脊柱VX2肿瘤转移模型的作用研究

黄昊，何仕诚，冯国栋，杜瑞杰，朱海东，方文，郭金和，邓钢

骨水泥对兔脊柱VX2肿瘤转移模型的作用研究

黄昊，何仕诚，冯国栋，杜瑞杰，朱海东，方文，郭金和，邓钢

目的探讨聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥对兔脊柱VX2肿瘤的杀伤作用。方法成功建立兔VX2脊柱转移肿瘤模型18只，随机分为A、B、C组，每组各6只，在CT导下向VX2肿瘤中心分别注入PMMA或生理盐水，其中A组注入PMMA 0.3 ml、B组注入PMMA 0.1 ml、C组注入生理盐水0.3 ml。术后24 h处死模型兔，A、B组分别于距离PMMA团块边缘1、5、10、15 mm处不同方向各取4个肿瘤组织块，C组于瘤体中心至表面不同的4个位置各取1块肿瘤组织，采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法检测肿瘤细胞凋亡率。结果16只模型兔成功注入PMMA骨水泥，A、B组手术成功率均为5/6，C组为6/6，无显著性差异。A组距PMMA边缘1、5、10 mm处肿瘤细胞平均凋亡率分别为（65.75±18.81）%、（50.00±14.24）%、（14.95±8.98）%，与对照组（9.79±5.24）%相比差异均有统计学意义（P＜0.05）；15 mm处肿瘤细胞平均凋亡率为（10.30±8.13）%，与对照组相比差异无统计学意义。B组距PMMA边缘1、5 mm处肿瘤细胞平均凋亡率分别为（49.20±15.57）%、（17.75±9.28）%，与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），其余观测点无显著性差异。A、B两组距PMMA边缘1、5、10 mm处肿瘤细胞平均凋亡率比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）。结论PMMA可促进肿瘤细胞凋亡，适量增加PMMA注入量可增加肿瘤细胞凋亡范围。

聚甲基丙烯酸甲酯；兔；VX2肿瘤；脊柱转移；凋亡

各种恶性肿瘤晚期发生脊柱转移可达30%～70%，对其治疗的主要目的是缓解局部疼痛、改善神经功能、保持脊柱稳定性，并尽可能控制局部病灶［1］。经皮椎体成形术（PVP）经过20余年发展已成为治疗脊柱转移瘤的重要手段，但术中所使用的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥是否对其周围的肿瘤组织有杀伤作用，尚未得到肯定的验证［1-3］。本研究在前期建立的可重复、较稳定的兔脊柱肿瘤转移模型基础上，在经CT导引下经皮穿刺注入PMMA，以探究其对肿瘤的杀伤作用。

1　材料与方法

1.1材料

实验取新西兰大白兔25只（3～4月龄，体重2.5～3.5 kg，雌雄不限），由东南大学动物实验中心提供（实验动物许可证编号：SYXK苏-2010-0004）。VX2肿瘤株由东南大学分子影像与功能影像实验室提供，每隔4周经兔大腿部肌肉成瘤传代。实验材料还包括乙二胺四乙酸（EDTA，武汉博士德生物工程有限公司）、苏木精-伊红（HE，上海碧云天生物技术有限公司）、4%甲醛（东南大学附属中大医院病理科）、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）试剂盒（瑞士Roche公司）。

1.2方法

1.2.1兔脊柱VX2肿瘤转移模型的建立兔脊柱VX2肿瘤模型的建立和影像学评价方法参照凌龙等［2］报道。术后28 d行腰椎CT扫描检查，观测到兔椎体伴有明显骨质破坏时视为建模成功（图1①）。1.2.2实验分组及手术步骤成功构建兔脊柱VX2肿瘤模型共计18只，随机分为A、B、C组，每组6只。实验手术于第28天施行，1%异戊巴比妥钠（3 ml/kg）经耳缘静脉麻醉模型兔并固定行腰椎CT平扫，用18 G血管穿刺针在CT导引下穿刺入椎体中心，A、B两组分别注入PMMA 0.3 ml和0.1 ml（图1②③），C组为对照组（仅注入生理盐水0.3 ml）。PMMA按临床常用比例调配后120 s开始注入［3］。

1.2.3术后观察与评价术后24 h为观察终点，处死实验兔后取出目标椎体，脱钙后逐层切片，选取肿瘤侵蚀椎体面积最广的层面进行观察。实验组于PMMA周围4个方向，分别距PMMA边缘1 mm（紧贴PMMA边缘处）、5 mm、10 mm及15 mm处各取一肿瘤组织块，对照组于瘤体中心至表面不同的4个位置各取一肿瘤组织块，并行HE染色及TUNEL染色［4］后，检测肿瘤细胞凋亡指数（AI）［5］。

1.3统计学处理

2　结果

2.1手术情况

25只新西兰大白兔中18只成功建立兔脊柱VX2肿瘤模型，建模成功率为72%（18/25）。注入PMMA前共有15只模型兔出现后肢瘫痪，A、B、C组各5只。

图1　兔脊柱VX2肿瘤模型注入PMMA实验

18只脊柱VX2肿瘤模型兔穿刺均获成功，其中A、B实验组共10只模型兔（10/12）成功注入PMMA，达到实验预期终点。A组有4只模型兔椎体旁出现少量PMMA渗漏，术中麻醉死亡1只；B组椎体旁均无PMMA渗漏，术中麻醉死亡1只。对照组实验均获成功（6/6）。对照组与实验组间手术成功率比较，差异无统计学意义（P=0.529）。术后所有存活实验兔后肢情况与术前相同。

2.2组织学检查

术后24 h共取出A、B组转移瘤椎体各5节，C组转移瘤椎体6节。组织HE染色结果见图2，TUNEL荧光染色见图3。术后距PMMA边缘不同距离肿瘤细胞凋亡率见表1。A组距PMMA边缘1、5、10 mm处肿瘤细胞平均凋亡率与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而15 mm处肿瘤细胞平均凋亡率与对照组比较，差异无统计学意义；B组距PMMA边缘1、5 mm处肿瘤细胞平均凋亡率与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），其余观测点无统计学差异。A、B组距PMMA边缘1、 5、10 mm处肿瘤细胞平均凋亡率比较，差异均有显著统计学意义（P＜0.001）。

图2　兔脊柱VX2肿瘤模型注入PMMA后病理表现

表1　VX2肿瘤不同位置标本细胞凋亡率

图3　距PMMA边缘不同距离VX2肿瘤标本的TUNEL染色荧光显微镜下表现（×400）

3　讨论

3.1兔脊柱VX2肿瘤转移模型注入PMMA方法

由于CT可准确显示穿刺针进入靶椎体肿瘤骨质破坏区内，故本实验采用经椎体侧后缘与椎弓根交界处穿刺入路注入PMMA［2］，手术成功率分别为实验组10/12、对照组6/6，组间无显著性差异。我们检索了Medline、中国万方及知网等数据库，迄今未见有兔椎体内注入骨水泥的相关研究报告，因而在本实验前关于兔椎体内应注入多少量骨水泥无经验可参考。为此，我们进行多次预实验，发现兔腰椎内PMMA注入量增加至0.5 ml时均有PMMA较多渗漏入椎管，而本实验组PMMA渗漏发生率为40%（4/10），均发生于注入PMMA 0.3 ml的A组，提示随着PMMA注入量增加，渗漏发生风险也随之增大，故兔脊柱VX2肿瘤内注入PMMA量不宜超过0.3 ml。

3.2PMMA对VX2肿瘤杀伤作用的评价

凋亡作为细胞死亡的形式之一，可在一定程度上反映细胞周围环境刺激或变化的情况［6］。正常或繁殖细胞没有脱氧核糖核酸断裂，不被TUNEL染色，因此本实验采用TUNEL法［7］评价PMMA对肿瘤杀伤程度及范围是切实可行的。

尽管PMMA对肿瘤细胞具有急性杀伤作用已被证实［8］，但杀伤程度及范围是否与注射量相关，仍然无肯定结论。Wang等［9］研究发现，VX2肿瘤自然生长4周内一般无明显坏死（即细胞自然凋亡作用较小），且兔脊椎内植入VX2肿瘤约28 d时CT可观测到兔椎体伴有明显骨质破坏［2］，故本实验选择在兔脊椎内植入VX2肿瘤后第28天时注入PMMA并设置对照组，从而避免肿瘤细胞自然凋亡的干扰。通过本实验可以推论，注入PMMA 0.1 ml对VX2肿瘤细胞的杀伤范围为5～10 mm，而注入PMMA 0.3 ml则为10～15 mm。我们认为，在一定范围内增加PMMA注射量可增加对肿瘤细胞的杀伤作用。

Bhatt等［1］研究认为，PMMA对肿瘤的杀伤机制可能在于：①PMMA单体细胞毒作用；②PMMA聚合热作用。然而本实验中，B组中单体理论注射量仅为0.02 ml，且大部分已与PMMA粉剂聚合，PMMA 0.1 ml注射后肿瘤细胞凋亡范围约为5 mm，因此仅用单体细胞毒性解释其杀伤作用难以令人信服；PMMA 4 ml聚合时产生的最高温度可达61℃［10］，增加PMMA注射量可增加其与肿瘤的接触面积，同时产生的总热量（Q=Δt·m·c）也势必增加，我们因而认为聚合热对肿瘤起主要杀伤作用。Chen等［11］研究认为，血流及脑脊液流动会造成热量散失，骨组织与软组织之间热传导也存在差异，这些均会对肿瘤与脊髓的实际温度产生影响，可见采用兔脊柱VX2肿瘤转移模型研究PMMA对肿瘤的杀伤作用的可信度应更高。本实验中A组1 mm处肿瘤细胞凋亡率与B组比较有显著差异，提示增加PMMA注射量可提高肿瘤细胞凋亡率。

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The killing effect of bone cement on spinal metastasis of transplanted VX2 carcinoma in experimentalrabbit models

HUANG Hao，HE Shi-cheng，FENG Guo-dong，DU Rui-jie，ZHU Hai-dong，FANG Wen，GUO Jin-he，DENG Gang.Department of Radiology，Affiliated Zhongda Hospital，Southeast University，Nanjing，Jiangsu Province 210009，China

HE Shi-cheng，E-mail：shichenghe@vip.sina.com

ObjectiveTo investigate the killing effect of polymethylmethacrylate（PMMA）on spinal metastasis of transplanted VX2 carcinoma in experimental rabbit models.MethodsSpinal metastasis of transplanted VX2 carcinoma model was successfully established in 18 rabbits.The experimental rabbits were randomly and equally divided into three groups with 6 rabbits in each group.Under CT guidance，PMMA or saline was injected into the center of VX2 tumor；in group A 0.3 ml of PMMA was used，in group B 0.1 ml of PMMA was used and in group C（control group）0.3 ml saline was used.Twenty-four hours after the injection，the animals were sacrificed.Four tissue samples were obtained from the sites at 1 mm，5 mm，10 mm and 15 mm away from the PMMA mass in each rabbit of group A and group B，while four tissue samples were collected from different four sites from the tumor's center to border in each rabbit of group C. TdT-mediated dUTP nick-end labeling（TUNEL）method was used to determine the tumor cell apoptosis rate. ResultsAfter successful establishment of rabbit model，injection of PMMA was performed in sixteen amongthe eighteen rabbits.Technical success rates were 83.3%in both group A and B，and the success rate was 100%in group C.The difference in technical success rate was not significant.The mean tumor cell apoptosis rates of spinal VX2 carcinoma at 1 mm，5 mm and 10 mm away from the PMMA mass in group A were（65.75±18.81）%，（50.00±14.24）%and（14.95±8.98）%respectively.The mean apoptosis rate in the control group was（9.79±5.24）%；the differences between the group A and the control group were statistically significant（P＜0.05）.The mean tumor cell apoptosis rate of spinal VX2 carcinoma at 15 mm away from the PMMA mass in group A was（10.30±8.13）%，which was not significantly different with that of the control group.The mean tumor cell apoptosis rates of spinal VX2 carcinoma at 1 mm and 5 mm away from the PMMA mass in group B were（49.20±15.57）%and（17.75±9.28）%respectively，which was significantly different with that of the control group（P＜0.05）；the mean tumor cell apoptosis rates at 10 mm and 15 mm away from the PMMA mass in group B were not significantly different with those of the control group.Statistically significant differences in the mean tumor cell apoptosis rates determined at 1 mm，5 mm and 10 mm away from the PMMA mass existed between group A and group B（P＜0.001）.ConclusionPMMA can promote the apoptosis of tumor cells，properly increasing the injected amount of PMMA can enlarge the extent of tumor cell apoptosis.（J Intervent Radiol，2015，24：520-523）

polymethylmethacrylate；rabbit；VX2 carcinoma；spinal metastasis；apoptosis

R681.5

A

1008-794X（2015）-06-0520-04

2014-11-27）

（本文编辑：边佶）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.06.013

国家自然科学基金（81171434）、江苏省临床医学科技专项项目（BL2013029）

210009南京东南大学附属中大医院放射科（黄昊、冯国栋、杜瑞杰）、介入与血管外科（何仕诚、朱海东、方文、郭金和、邓钢）

何仕诚E-mail：shichenghe@vip.sina.com