Dis-SPE-HPLC-DAD检测水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药

董祥芝，安凤秋，李庆，同帜

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安710048）

Dis-SPE-HPLC-DAD检测水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药

董祥芝，安凤秋，李庆，同帜

（西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安710048）

建立了高效液相色谱-二极管阵列检测水果中涕灭威、西维因、异丙威、仲丁威、马拉硫磷等5种有机磷和氨基甲酸酯农药的方法。前处理方法采用分散固相萃取，样品以乙腈提取，经无水硫酸镁和氯化钠盐析，PSA净化后，进行HPLC-DAD检测。以甲醇/水（体积比70/30）为流动相，流速1 mL/min。DAD检测器的波长设定为210 nm。5种农药在0.04 μg/mL～4 μg/mL范围内线性相关系数均高于0.99，检出限在0.057 μg/mL～0.60 μg/mL之间。样品在0.2、0.4、2 μg/mL的加标水平时，平均回收率为73.32%～93.12%，RSD为3.46%～9.36%（n=6）。与传统固相萃取方法相比，分散固相萃取具有简便、省时、高精确度和高回收率的优点，可以作为水果中农药残留的日常检测方法。

分散固相萃取；HPLC-DAD；有机磷；氨基甲酸酯

氨基甲酸酯和有机磷农药是在蔬果中使用率较高的农药品种，经常用于提高农作物的产量，但是它们在蔬果中的残留，以及所带来的毒性已受到人们的广泛关注。传统的样品前处理方法，如索氏提取［1］、溶剂提取［2］，超声萃取［3］，以及常规的固相萃取［4-5］、基质分散固相萃取［6-8］等技术，都存在着用时长、所需溶剂多、易造成二次污染的缺点。分散固相萃取最早是由Anastassiades等在2003年提出的［9］，因其快速（Quick）、简单（Easy）、低廉（Cheap）、高效（Effective）、耐用（Rugged）、安全（Safe）等特性，又被称为QuEChERS法，被美国农业部定为最新农药残留检测方法［10-12］。

由于有机磷和氨基甲酸酯的热稳定性相差较大，不宜使用GC同时进行分离。但通过LC，无需衍生，可以同时对有机磷和氨基甲酸酯农药进行检测［13］。目前鲜见有使用分散固相萃取-液相色谱-二极管阵列检测器（diode array detection，DAD）对水果中的有机磷和氨基甲酸酯农药进行检测的文章。因此，本文的目的在于建立分散固相萃取净化，对水果中的有机磷和氨基甲酸酯类农药进行HPLC-DAD分离和检测的快速分析方法。

1材料与方法

1.1材料与仪器

农药标准样品涕灭威、西维因、异丙威、仲丁威、马拉硫磷（100 μg/mL，甲醇溶剂，纯度98%～99%）：中国农业部环境保护监测机构，在-20℃进行保存；甲醇、乙腈（色谱纯）：美国Fisher公司；无水硫酸镁和氯化钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；PSA（乙二胺基-N-丙基，primary secondary amine）：德国Macherey-Nagel公司；超纯水由实验室自制；水果样品随机购于当地市场。

Agilent 1200型液相色谱仪：美国Agilent公司；艾科浦AWJ2-2009-U型超纯水系统：重庆颐洋企业发展有限公司；5810R型高速冷冻离心机：德国eppendorf公司；BB332-A多功能食物搅拌机：佛山市顺德伍发电器公司；QL-901型旋涡振荡仪：海门市其林贝尔公司；HH-S4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司。

1.2色谱条件

色谱柱：vp-ODS-C18column（ZORBAXSB，4.6mm× 250 mm，5 μm）；流动相：甲醇/水（V/V，70/30）；流速：1 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 μL。DAD检测器的波长设定为210 nm。

1.3标准溶液的配制

先将标准溶液用甲醇配制成20 μg/mL的混合标准溶液，再根据需要用甲醇稀释成4、2、0.4、0.2、0.04 μg/mL的混合标样，所有的试剂避光存放于-4℃冰箱中保存。

1.4样品前处理

样品经食品搅拌机充分混合匀浆，准确称取5 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈后，在漩涡振荡器中进行充分搅拌。加入1 g MgSO4和1 g NaCl后立即再振荡1 min后，10 000 r/min离心10 min。取上清液1mL于1.5 mL的离心管中，并加入50 mg PSA和50 mg MgSO4，漩涡振荡1 min后，10 000 r/min离心10 min。将上清液经0.22 μm的滤膜过滤后，直接进液相色谱进行DAD检测。

2结果与讨论

2.1萃取溶剂及样品量的选择

甲醇、乙腈和丙酮是较为常用的农残萃取溶剂。但乙腈能够有效的将水果表面的蜡质物、脂肪及有机色素排除在外，饱和水层更容易与乙腈层实现分离，因此选择乙腈作为萃取溶剂。

为实现最佳的萃取效率，优化了样品量和萃取溶剂的比例。选取10 mL MeCN，1 g MgSO4和1 g NaCl，分别对1、3、5、8、10 g样品进行萃取。离心后观察到上清液的颜色均较为透明，说明10 mL MeCN能够满足选定的样品量的萃取。但样品越多，上清液的转移就越困难。因此，最终选择5 g样品和10 mL MeCN来进行后续的实验。

2.2检测波长的确定

对5种农药进行了紫外光谱扫描，以确定最佳吸收波长。从图1中可以看出5种农药的最佳紫外吸收波长为270 nm。但有文献分别选定210 nm和254 nm作为最佳吸收波长进行检测［14-15］。因此本实验选择210、245及270 nm 3种波长进行液相色谱DAD检测，发现在245 nm和270 nm处待测物的灵敏度非常差，见图2。综合考虑紫外响应值和准确性，选择210nm作为最终检测波长。

图1　5种农药紫外吸收光谱图Fig.1UV spectra of pesticides

2.3分散固相萃取条件的优化

图2　3种不同波长下的农药混标色谱图Fig.2Liquid chromatogram of standard mixture pesticides at different wavelengths

分散固相萃取是将净化和干燥同时进行的，MgSO4的作用主要有两方面：一是促进两相分离；二是消除极性杂质。实验发现，MgSO4的量对西维因、仲丁威及马拉硫磷的回收率影响不大。但是对涕灭威和异丙威，增加MgSO4的量，回收率会急剧下降。这是因为涕灭威和异丙威在水中的溶解度要远远大于其他3种待测物，当样品的含水量较少时，加入过量的MgSO4反而容易成块，从而带来不必要的损失。所以最终选择1 g MgSO4。

NaCl的盐析作用可以让水相趋于饱和来促进水相和有机相的分离。由于待测物均为疏水性物质，且已加入MgSO4将样品中的水分吸附，因此1g NaCl即能达到最佳分离。

PSA同时具备伯胺和叔胺基团，可以将基质中的色素、有机酸、糖类等从待测物中提取出来。当PSA由25 mg增加至100 mg时，涕灭威的回收率有所增加；马拉硫磷的回收率有所下降。使用50 mg PSA时，异丙威和仲丁威的回收率最好（图3）。因此最终选择50 mg的PSA进行后续试验。

图3　PSA对回收率的影响（n=6）Fig.3The effect of PSA amount on the recovery of pesticides（n=6）

为彻底除去残留的水分，在微量离心管中加入少量的MgSO4。分别加入50、100、150 mg MgSO4后发现西维因的回收率从74%增加到89%，但其他待测物回收率都有所下降。这是因为MgSO4的加入量越大，上清液的移除越困难。因此最终选择在微量离心管中加入50 mg MgSO4为最佳条件。

2.4方法线性关系

配制0.04 μg/mL～4 μg/mL的标准溶液，在优化条件下建立标准曲线，相关系数R2均高于0.99（表1）。检出限（LODs）和检测限（LOQs）分别在0.057 μg/mL～0.60 μg/mL和0.19 μg/mL～1.99 μg/mL之间。

表1　待测物的LOD、LOQ、线性方程及相关系数（n=6）Table 1LOD，LOQ（μg/mL）and standard curve for each analytes（n=6）

2.5加标回收率和精密度

选择有机苹果作为对试验方法的验证基质，因为有机水果没有添加任何农药或除草剂，加标浓度为0.2、0.4、2 μg/mL 3个浓度水平，每个水平平行检测6次。5种待测农药的加标回收率为73.32%～93.12%，相对标准偏差（RSD）在3.46%～9.36%之间（表2），结果表明本方法符合检测要求。

表2　苹果样品中待测农药的加标回收率、精密度（n=6）Table 2The spiked recoveries and precisions of the analytes pesticides in apple sample（n=6）

2.6实际样品的应用

将优化后的试验方法用于市场购买的不同种类、不同含水量和基质的水果样品，包括香蕉、橙子、梨和苹果，结果见表3和图4。香蕉作为热带水果，含水量最少，含糖量最多；橙子和苹果有大量的有机酸；梨中有大量的碳水化合物。所有的农药样品的回收率在70.79%～91.26%之间，RSD均低于10%。说明本方法可以较好的应用于所选择的水果样品。

3结论

本实验建立了分散固相萃取-液相色谱对常见水果中涕灭威、西维因、异丙威、仲丁威、马拉硫磷等5种有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测方法。样品用乙腈提取，优化了分散固相萃取的实验条件。样品在0.2μg/mL～2μg/mL的加标范围内，平均回收率在73.32%～93.12%，RSD为3.46%-9.36%（n=6）。并将本方法应用于其他常见水果中，农药样品的回收率在70.79%～91.26%之间，RSD均低于10%。实验证明该方法具有操作方便、耗时短、回收率高、重现性好等优点，可以用于水果样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的常规检测方法。

表3　加标0.4 μg/mL实际样品中待测物的回收率和RSD（n=6）Table 3Recovery and RSD of the pesticides in different samples spiked with 0.4 μg/mL（n=6）

图4　加标香蕉样品的农药色谱图（0.4 μg/mL）Fig.4Typical chromatogram of pesticides in spiked banana sample（0.4 μg/mL）

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Determination of Organophosphorus and Carbamate Pesticides in Fruits Using HPLC-DAD with Dispersive Solid-Phase Extraction

DONG Xiang-zhi，AN Feng-qiu，LI Qing，TONG Zhi
（College of Environmental and Chemical Engineering，Xi'an Polytechnic University，Xi'an 710048，Shaanxi，China）

A method has been developed for five OPPs and Carbamate pesticides（aldicarb，carbaryl，isoprocarb，fenobucarb，malathion）in fruit samples by high performance liquid chromatography coupled with diode array detector（HPLC-DAD）.Dispersive solid-phase extraction（Dis-SPE）has been used for the preparation：the samples extracted with acetonitrile，salted-out by anhydrous magnesium sulfate and sodium chloride，then cleaned up with PSA，finally analyzed by HPLC-DAD.The mobile phase was methanol/water（V/V，70/30）at a total flow rate of 1 mL/min.The DAD wavelength was 210 nm.The method showed good linearity over the ranges of 0.04 μg/mL-4 μg/mL for five pesticides with correlation coefficients all above 0.99，and the limits of detection were 0.057 μg/mL-0.60 μg/mL.The average recoveries ranged from 73.32%to 93.12%with the RSD were 3.46%-9.36%（n=6）at spiked levels of 0.2，0.4，2 μg/mL.Compared with conventional SPE cleanup，dis-SPE greatly simplified and accelerated sample cleanup and less timeconsuming.Meanwhile，the high recoveries and good accuracy showed the optimal experimental conditions were satisfied.This method was applied to pesticide residue monitoring in fruits from local markets.

dispersive solid-phase extraction（dispersive SPE）；high performance liquid chromatographydiode array detector（HPLC-DAD）；organophosphorus；carbamate pesticides

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.025

2014-07-01

董祥芝（1984—），女（汉），工程师，硕士，主要从事分析化学、仪器管理工作。