氨基酸类成分的高效液相指纹图谱鉴别不同产地绞股蓝研究

陈培云，王献友，赵志磊，庞艳苹，李晓杨

（河北大学质量技术监督学院，河北保定071002）

氨基酸类成分的高效液相指纹图谱鉴别不同产地绞股蓝研究

陈培云，王献友，赵志磊，庞艳苹，李晓杨

（河北大学质量技术监督学院，河北保定071002）

采用氨基酸类成分的高效液相指纹图谱，实现对包括陕西平利在内的8个产地绞股蓝的鉴别。使用超声法提取绞股蓝水溶性氨基酸，采用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱－荧光检测法，建立绞股蓝氨基酸类指纹图谱，结合主成分分析、判别分析鉴别不同产地绞股蓝。结果表明主成分分析法明显把陕西平利和其他产地区开来，对其他产地也基本上能够进行区分，建立的判别分析模型稳定性良好。由此得出氨基酸类成分的高效液相指纹图谱结合主成分析分析可以实现平利绞股蓝和其他产地的有效区分，建立的判别分析模型，为保护平利绞股蓝原产地域产品以及其他不同产地的区分提供了新的方法途径。

绞股蓝；氨基酸类指纹图谱；原产地；主成分分析；判别分析

绞股蓝Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Maldno为葫声科Cucurbitaceae绞股蓝属草质藤本植物，又名天堂草、超人参和七叶参等。具有抑制肿瘤［1］、降低血脂、清热解毒、止咳袪痰等作用［1-2］。民间称其为“神奇”的“不老长寿药草”。绞股蓝被医学界誉为东方神草、人间福音草，现代研究表明绞股蓝含有皂苷、黄酮、氨基酸、植物蛋白、多糖、磷脂、维生素、纤维素、微量元素等［3-4］。

绞股蓝产地众多，地理分布广泛，不同产地的绞股蓝质量参差不齐，鱼龙混杂。地处北亚热带湿润季风气候区的平利县，由于雨量充沛，气候温和，日照充足，无霜期时间长，土壤有害物质含量低，成为中国国内生态型药用植物种植示范基地的最佳区域。根据《中华人民共和国产品质量法》和《原产地域产品保护规定》，国家质量监督检验检疫总局通过了对平利绞股蓝原产地域产品保护申请的审查，批准自2004年12月13日起对平利绞股蓝实施原产地域保护。

近年来，绞股蓝的研究主要集中在测定其中单一成分或某几种成分的含量［5-8］。对产地差异的研究主要有：秦江［9］等测定产自福建、湖北、广西、云南、浙江和陕西6种不同产地绞股蓝总皂苷的含量，比较这6种绞股蓝总皂苷组成成分的差异性，王晶［10］等测定了7个省产绞股蓝及其根际土壤中As，Hg，Se 3种元素的含量，进行分析比较。梁晓庆［11］等对5省绞股蓝Se、总蛋白及总皂苷含量进行测定，分析了三者相关性，刘芳［12］等建立绞股蓝药材黄酮类化合物的HPLC指纹图谱，对不同产地批次的绞股蓝药材进行质量评价。牛俊峰［13］等建立固相微萃取-气相色谱质谱方法，对采自4省市5个地区药用植物绞股蓝的挥发性化学成分进行定性定量分析。以上研究均未明确对绞股蓝产地来源进行区分，绞股蓝中富含氨基酸，不同产地绞股中蓝氨基酸含量不同，本文采用高效液相色谱法对包括平利在内的8个产地绞股蓝氨基酸类进行研究，并利用matlab软件进行主成分分析和spss进行判别分析，建立稳定可靠的模式识别方法。该研究结果为维护名贵中药材市场的经济秩序，保护地理标志产品的声誉提供技术支撑。

1材料与方法

1.1材料与仪器

邻苯二甲醛（上海源叶生物科技有限公司，分析纯），β-巯基乙醇（amresco，分析纯），甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯），四氢呋喃（上海同试化工有限公司，分析纯），乙酸钠（天津市光复精细化工厂，优级纯），硼酸（天津市凯通化学试剂有限公司，≥99.8%），氢氧化钠（天津市北联精细化学品开发有限公司，≥98%优级纯），氨基酸对照品：天冬氨酸（20121123）、蛋氨酸（20110415）、赖氨酸（20130113）购自上海源叶生物科技有限公司，谷氨酸（14690-201203）、丝氨酸（14688-201001）、组氨酸（140693-201102）、甘氨酸（140689-201103）、苏氨酸（140682-201102）、丙氨酸（140680-201002）、色氨酸（140686-201002）、缬氨酸（14681-201202）、苯丙氨酸（140676-201106）、异亮氨酸（140683-201202）、亮氨酸（140687-201102）购自中国食品药品检定研究所）精氨酸（≥99.2%）酪氨酸（≥99.4%）购自中国计量科学研究院。实验用水为Milli-Q超纯水，流动相以0.45 μm的滤膜过滤。实验采用的8个绞股蓝药材分别来源于陕西、安徽、福建、广西、湖北、湖南、山东、四川。实验时每个产地取5个批次。

Agilent1100高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司；Agilent色谱工作站；色谱柱Kromasil C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；检测器Agilent G1321荧光检测器；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；高速中药粉碎机：武义县屹立工具有限公司。

1.2方法

1.2.1氨基酸标准溶液制备

分别精密称取16种标准氨基酸各0.25 g于25 mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容后备用。

1.2.2供试样品制备

绞股蓝在50℃～60℃下烘干干燥，干燥后的材料用植物粉碎机粉碎并过80目筛，准确称取绞股蓝0.6 g，置100 mL容量瓶中，用二次去离子水至近刻度，30℃超声提取30 min（100 kHz，80 w），冷却后，二次去离子水定容至刻度，10 000 r/min离心弃去沉淀，离心液用0.45 μm滤膜过滤，备用。

1.2.3衍生及分析

衍生试剂的配制：称取0.27 g邻苯二甲醛（OPA）溶于5 mL无水乙醇中，加入100 μL2-巯基乙醇，用0.4 mol/L的硼酸（pH=9.5，氢氧化钠溶液调制）定容到50 mL，混匀，置于暗处，每隔1天补加10 μL巯基乙醇，每周需重新配制。

移取100 μL标准溶液或样品于2 mL的棕色样品瓶中加入等量的OPA衍生化试剂，在混匀器中混匀，反应1.5 min，取50 μL（定量环为20 μL）注入高效液相色谱仪，按下述色谱条件操作，记录30 min色谱图。

1.2.4色谱条件

色谱柱为Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相（A）：0.05mol/LNaAc+0.5%THF；流动相B：甲醇。梯度洗脱线性梯度：（T，B%）（0 min，20%）（27 min，88%）（34min，20%）。流速为1.0 mL/min，柱温为35℃，荧光检测激发波长为340 nm，发射波长为460 nm，进样量为20 μL。每次样品完成后，系统平衡10 min。

1.2.5数据处理方法

液相色谱图通过《中药指纹图谱相似度评价系统研究（2004试行版）》处理分析。使用matlab进行主成分分析，spss进行判别分析。

2结果与分析

2.1方法学验证

2.1.1方法的专属性

在上述色谱条件下进样分析，标准溶液、样品色谱图见图1（A、B、C）。

由图1可见氨基酸在26 min内基本达到了完全分离，内源性物质及衍生化试剂不干扰氨基酸的测定。方法具有较好的专属性。

图1　HPLC图Fig.1Chromatogram of amino acids constituents

2.1.2精密度试验

将处理好的绞股蓝的水提取液，分别按照“2.1.4”项下方法进行衍生，按2.1.1实验条件，重复进样6次，记录色谱图，结果表明，各主要色谱峰的相对酪氨酸参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.10%～0.32%、0.28%～3.3%，图谱导入相似度软件处理，相似度均在0.998以上，表明仪器精密度良好。

2.1.3重复性试验

精密称取同一绞股蓝5份，分别按照“2.1.3”项下方法处理，然后分别进行衍生、进样，记录色谱图。结果各主要色谱峰相对酪氨酸参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别0.2%～1.5%，0.26%～3.5%，图谱导入相似度软件处理，相似度均在0.983以上，表明本方法重复性好。

2.1.4稳定性试验

精密吸取同一绞股蓝供试品溶液，分别在0、2、4、8、10、12、24 h衍生进样，记录色谱图。结果各主要色谱峰相对酪氨酸参照峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.58%～2.65%、0.69%～2.39%，图谱导入相似度软件处理，相似度均在0.982以上，表明供试品溶液在24 h内稳定，稳定性良好。

2.2绞股蓝氨基酸指纹图谱的建立

将8个不同产地40批绞股蓝药材按2.1项的条件进样，通过化学工作站按表1进行积分，使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版），设定时间窗0.5，对40批不同产地绞股蓝药材HPLC指纹图谱进行共有峰标定，结果表明共有11个峰面积在100以上的共有峰，并对同一产地样品的色谱峰进行自动匹配生成中位数对照指纹图谱，得到每个产地的对照谱图，如图2。

图2　不同产地绞股蓝氨基酸指纹对照谱图Fig.2Fingerprints of amino acids constituents of Gynostemma pentaphylla from different Localities

2.3绞股蓝药材指纹图谱的相似度评价

使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对每一产地的5个批次绞股蓝样品相似度计算结果如表2，对8个产地绞股蓝的对照图谱数据进行分析，以陕西平利为参考图谱计算相似度，结果如表3所示。

由表2、表3可见，同一产地绞股蓝的指纹图谱相似度均大于0.97，说明同一产地绞股蓝中氨基酸含量相近，由表3可见，8个产地对照指纹图谱相似度除广西外均大于85%，说明它们性质较为相近，仔细比较各个样本的相似度又存在一定地差别，低的只有79%左右，高的接近96%，但不能明确将不同产地样品区分开，因此认为使用传统的相似度评价指标进行分析得到的结果较为模糊，不能明确的区分产地。

表2　同产地绞股蓝相似度计算结果Table 2The similarity Gynostemma pentaphylla between the same cultivation areas

表3　不同产地绞股蓝的相似度Table 3The similarity Gynostemma pentaphylla between different cultivation areas

2.4主成分分析

根据绞股蓝药材的HPLC指纹图谱确定共有峰11个，其中峰8（酪氨酸）为绞股蓝中主要的氨基酸成分，在HPLC色谱图中分离良好，含量较高且稳定，选择峰8为参照峰。并对共有峰的相对峰面积比值进行考察，结果见表4。将11个共有峰峰面积比值数据导入MATLAB软件中，进行主成分分析。

表4　8个产地11个共有峰的相对峰面积Table 4The relative peak area of common peaks for eleven batches of eight areas

分析结果表明前3个主成分的累积贡献率已达到98.85%，前3个主成分概括了大部分的数据信息，因此使用提取的前3个主成分得分作三维图，观察前3个主成分得分情况，可发现各产地样品具有明显的聚类趋势。椭圆形圈中部分为陕西样品。能够与其他产地区分开来。将各点投影到平面上，所得结果如图3，可看出样品很明显的分为8类，不同产地的聚在一起成为一类，可见该方法可在一定程度上实现绞股蓝产地识别。

图3　前三主成分得分投影图Fig.3Projection of the first three principal component scores

2.5判别分析

以各产地的11个相对峰面积前3个主成分得分及其所述属的类型作为评价新指标，运用SPSS19.0软件，对所得的数据进行贝叶斯判别分析，以所有组先验概率相等进行判别，所建模型对初始分组案例的分类正确率达到了97.5%，交叉验证的概率为95%，表明该模型的稳定性良好。可写出8个产地的贝叶斯判别函数，分别为：

其中Xi为第i个主成分得分，将待判样品的前3个主成分得分分别带入上述8个贝叶斯判别函数中，计算每个判别函数的函数值g安徽、g福建、g广西、g湖北、g湖南、g山东、g四川、g陕西。根据贝叶斯后验概率最大原则，哪个函数值最大，则待判样品属于哪一类。

3结论

超声法提取绞股蓝水溶性氨基酸，采用邻苯二甲醛柱前衍生高效液相色谱－荧光检测法，建立绞股蓝氨基酸类指纹图谱，利用氨基酸类成分的高效液相指纹图谱，结合主成分分析、判别分析对不同产地的绞股蓝样品进行分析。结果表明，传统的使用相似度作为评价指标进行分析得到的结果较为模糊，不能明确的区分产地。而使用PCA方法明显把陕西平利和其他产地区分开来，对其他产地也基本上能够进行区分。利用前三组成分得分所建立的判别分析模型，为保护平利绞股蓝原产地域产品以及其他不同产地的区分提供了新的方法途径。

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Study on HPLC Fingerprints of Amino Acids Constituents for Identification of Gynostemma Pentaphylla from Different Localities

CHEN Pei-yun，WANG Xian-you，ZHAO Zhi-lei，PANG Yan-ping，LI Xiao-yang
（College of Quality&Technical Supervision，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China）

To establish a fingerprint analytical method according to the amino acids constituents for Identification of Gynostemma pentaphylla from eight different Localities including pingli shanxi.Free Amino Acids in Gynostemma pentaphylla were extracted by ultrasonic under water conditon，derivatized by O-phthalaldehyde，separated by Kromasil C18 column，monitored by a fluorescence detector，A HPLC fingerprints of amino acids constituents was established.Similarity combined with principal component analysis（PCA）and discriminant analysis were used to compare and analyze Gynostemma pentaphylla in different localities.PCA could discriminate clearly Gynostemma pentaphylla cultivated pingli from other cultivation areas，also could basically carry on the discrimination between other cultivation areas.And a stable discrimination analysis model was established.HPLC fingerprints of amino acids constituents coupled with PCA could be used to compare and discriminate Gynostemma pentaphylla cultivated pingli from other cultivation areas，the established discrimination analysis model for pingli cultivation areas and other cultivation areas provided a new method for protecting Gynostemma pentaphylla cultivated pingli source territory and identifying different localities.

Gynostemma pentaphylla；fingerprints of amino acids constituents；source territory；principal component analysis；discriminant analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.024

2014-02-09

质检公益性行业科研专项项目（201210010-4）；河北大学2014-2015实验室开放项目

陈培云（1973—），女（汉），高级实验师，博士，主要从事食品分析检测研究。