茎瘤芥乳酸菌饮料稳定性研究及工艺条件优化

徐安书，郭健，殷永玲

（1.重庆工贸职业技术学院，重庆408000；2.重庆市涪陵区农产品质量安全检测管理站，重庆408000）

茎瘤芥乳酸菌饮料稳定性研究及工艺条件优化

徐安书1，郭健2，殷永玲1

（1.重庆工贸职业技术学院，重庆408000；2.重庆市涪陵区农产品质量安全检测管理站，重庆408000）

基于茎瘤芥胡萝卜混合汁乳酸菌饮料稳定性研究基础上进行工艺条件优化，进一步研究发酵过程中酸度对感官品质和组织状态的影响，采用四因素三水平正交实验，研究菌种比例、接种量、发酵温度、发酵时间对发酵过程中稳定性的影响，根据沉淀率的大小判定其稳定性，试验结果：保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌比例为1∶1，母发酵剂接种量3%，发酵温度37℃，发酵时间12 h，均质压力20 MPa，均质温度在30℃～40℃之间，2次均质，效果更好，最后添加复合稳定剂耐酸羧甲基纤维素钠CMC0.3%+黄原胶0.01%。

茎瘤芥；胡萝卜；乳酸菌；稳定性；优化工艺

茎瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）为十字花科（Cruciferae）芥属（Brassica）芥菜种的一个变种，是榨菜加工的原料作物。茎瘤芥乳酸菌饮料是以涪陵地产的茎瘤芥为主要原料、添加胡萝卜汁（两种汁比例6∶4），脱脂乳4%，母发酵剂接种量3%，发酵温度37℃，发酵时间12h，两次均质，均质压力20MPa，均质温度30℃～40℃，杀菌温度100℃，杀菌时间10min，最后添加杀菌后的稳定剂［1］。综合蔬菜原料的营养、保健成分与乳酸菌的独特的保健功能，制成一种既营养又能提高茎瘤芥附加值的一种营养保健食品，该饮料既具有蔬菜天然色素和营养、较高活性乳酸菌数量，又具有乳酸发酵的风味和特点［2］。糖酸比合适，口感协调，卫生指标合格，制品可保持一年以上。

通过添加乳酸菌发酵后的茎瘤芥胡萝卜乳酸菌饮料综合蔬菜原料的营养、保健成分与乳酸菌的独特的保健功能，制成一种既营养又能提高茎瘤芥附加值的一种营养保健食品，深受消费者的喜爱。然而，我们在茎瘤芥叶胡萝卜混合汁复合乳酸菌饮料的稳定性研究基础上进一步对发酵过程中酸度的控制及发酵工艺条件进行了进一步优化，得到稳定性较强的发酵工艺参数，为该类型产品工业化生产与研究提供理论依据。研究发现发酵过程中酸度是主要影响稳定性的因素之一，而酸度的产生又跟菌种种类及比例、发酵温度和时间、接种量等因素有直接关系，其中发酵时间影响最大。

1材料与方法

1.1材料

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）简写St、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckiisubsp）简写Ld：购于中国食品发酵工业研究院；MRS培养基：市售；涪陵地产茎瘤芥；胡萝卜、食用级蔗糖和葡萄糖、脱脂奶粉：市售；氢氧化钠，碳酸钠，pH缓冲液（邻苯二甲酸氢钾）、羧甲基纤维素钠果胶酶（活力≥500 000 U/g）：成都科龙；稳定剂均为食品级；柠檬酸、VC、黄原胶、氯化钠：均由重庆工贸职业技术学院生物化学工程系实验室提供。

1.2仪器

PX-300B型生化培养箱：上海跃进医疗器械厂；HG72-1恒温干燥箱：北京市朝阳区来广营医疗器械厂；梅特勒AR2140电子天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；生物显微镜（重庆奥特（B203LED）10×、40×、100×（平常消色差目镜）；CD-222KSA低温冰箱：青岛海尔股份有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；pHS-25数字式pH计：上海日岛科学仪器有限公司；GYB60-6S高压均质机：上海东华高压均质机厂；飞利浦HR1871榨汁机、HH-1数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；LG10-2.4A高速离心机等。

1.3方法

1.3.1菌种活化和驯化

将Ld和St按Ld∶St（1∶1、1∶2、2∶1）混合菌种分别接种到已灭菌并冷却的10%脱脂乳（NFM）培养基中，放置43℃培养24 h～48 h，传代3次～4次，取4 h内凝乳的酸奶。此时乳酸菌活力已达要求（平板计数法测定乳酸菌活菌数）。

将3种比例的混合菌种分别在脱脂乳和混合果蔬汁比例为9∶1的培养基中培养，再至两者比例为8∶2的培养基培养。直到两者比例为1∶9的培养基培养，最后用纯混合蔬菜汁培养。每次培养后均测定其乳酸菌数达到1.0×107CFU/mL以上，反复多次，至产酸较快生长良好为止，即得到3种比例混合种子液。

1.3.2蔬菜汁制备

1.3.2.1茎瘤芥汁

选择无病虫害的茎瘤芥（青菜头）→清洗→去皮筋→榨汁→四层以上沙布过滤→离心机离心→取上清液。

1.3.2.2胡萝卜汁

选择无霉烂、色泽橙红、肉厚、饱满的胡萝卜→清洗→切块→0.2%柠檬酸+0.1%VC混合液煮沸6 min→加入新鲜1/2质量的水→打浆→0.05%果胶酶在50℃保温液化酶解1 h→4层以上沙布过滤→离心机离心→取上清液［2］。

1.3.3母发酵剂的制备

蔬菜汁制备（茎瘤芥胡萝卜混合汁配比6∶4）+4%蔗糖+4%脱脂乳→搅拌溶解→高温杀菌（100℃，10 min）→迅速冷却至40℃→分别接种（5%经驯化后Ld∶St按1∶1、1∶2、2∶1比例混合种子液）→恒温培养（37℃，24 h）→分别测定其乳酸菌数达到要求→存放冰箱备用

1.3.4茎瘤芥胡萝卜混合汁乳酸菌饮料工艺流程

1.3.5试验设计方案

选取菌种比例（球菌：杆菌）、母发酵剂接种量、发酵温度、发酵时间为研究因素，4种因素采用正交L9（34）试验进行筛选，取样品10 mL，经3 500 r/min离心15 min，测定沉淀量的多少判定其稳定性。设计结果见表1。

表1　茎瘤芥胡萝卜混合汁乳酸菌饮料发酵L9（34）正交试验因素水平表Table 1Tumorous stem mustard carrot juice beverage of lactobacillus fermentation for L9（34）orthogonal test table level factors

1.2.6稳定性测试方法［3］

离心沉淀率检测：准确量取样品10 mL加入离心管中，在3 500 r/min离心15 min，弃去上部溶液，准确称取沉淀物重量，利用下列公式计算沉淀率。根据沉淀量的多少判定其稳定性，沉淀率越低，稳定性越好。

1.3.7乳酸菌数

MRS培养基平板计数法

1.3.8酸度

GB/T12456-2008食品中总酸的测定酸碱滴定法（°T测定：用0.1 mol/LNaOH直接滴定）。

1.3.9pH值

pHS-25数字式pH计直接计数。

1.3.10饮料基本参数

蛋白质含量≥0.7%，可溶性固形物13%，酸度DT=50，组织状态呈均匀细腻的乳淡黄色浑浊液，无异物，无分层现象。

2结果与分析

2.1发酵过程中酸度对稳定性的影响

将蔬菜汁（茎瘤芥汁∶胡萝卜汁=6∶4）按比例混合后调pH6.3，杀菌（100℃，10 min），冷却至40℃加入驯化后母发酵剂（Ld∶St=1∶1），接种量5%，设置6个恒温发酵温度，分别为37、38、39、40、41、42℃，分别测定12、24、36 h后的pH、滴定酸度，并进行感官品质和组织状态评定，结果见表2。

表2　茎瘤芥胡萝卜混合汁乳酸菌饮料发酵过程感官品质与组织状态Table 2Tumorous stem mustard carrot juice mixed fermentation of lactic acid bacteria beverage process sensory quality and structure

由表2得知，随着发酵时间延长，产酸量增多，pH下降，沉淀越多，流动性越来越差；饮料颜色由淡乳黄变黄褐色，香气由榨菜香变酸馊气味。在茎瘤芥乳酸菌发酵过程中，乳酸菌利用原料中乳糖作为其生长增殖的能量来源，在乳酸菌增殖过程中，其中的各种酶和酸将乳糖转化成乳酸。乳酸的形成使乳清蛋白和酪蛋白复合体越来越不稳定。当体系内的pH达到酪蛋白的等电点时（pH4.6～4.7），酪蛋白胶粒开始聚集沉降，逐渐形成一种蛋白质网络立体结构，其中包含乳清蛋白、脂肪和水溶液部分。这种变化使原料乳变成了半固体状态的凝胶体—酸乳，使乳饮料粗糙、不细腻，有沙砾状结构产生［4］。因此，影响茎瘤芥乳酸菌饮料稳定性因素之一是控制好发酵过程中酸度，而酸度的控制又与原料杀菌温度、菌种种类与接种量、发酵温度等因素有关［5］，所以说发酵过程的好坏直接影响到乳酸菌乳饮料的风味和稳定性。

2.2茎瘤芥胡萝卜混合汁乳酸菌饮料最佳发酵液正交试验结果

通过正交试验确定茎瘤芥胡萝卜混合汁乳酸菌饮料发酵过程中最佳菌种比例、母发酵剂接种量、发酵温度和发酵时间，试验结果见表3和图1。

表3　茎瘤芥胡萝卜混合汁乳酸菌饮料最佳发酵液正交试验表Table 3Tumorous stem mustard carrot juice beverage fermented liquid of lactic acid bacteria optimum orthogonal test table

图1　正交试验K值线形图Fig.1Orthogonal test K value of linear

由表3可以看出，方差分析结果优水平配方为A2B1C1D1，即菌种比例为∶嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=1∶1，母发酵剂接种量为3%，发酵温度37℃，发酵时间12 h。从极差分析中可见，影响试验的4个因素的大小顺序是D>A>B>C，即对茎瘤芥乳酸菌饮料风味稳定性影响最大的是发酵时间（RD=9.4），其次是菌种比例（RA=1.2），而接种量和发酵温度有一定温度，但影响不是很大。正交试验K值线性图如图1。

由图1可以看出，随着发酵温度的增高和发酵时间的延长，沉淀率明显增大，而且增减幅度较大，说明发酵时间是影响茎瘤芥乳酸菌饮料稳定性最大因素之一；随着杆菌和球菌比例的增大，沉淀率逐渐下降，直到相等，当杆菌大于球菌时，沉淀率又会上升，接种量在一定量内随着接种量增大，沉淀率有一定程度上升，但变化不大。

综上所述，最有利于茎瘤芥乳酸菌饮料稳定性的发酵条件是A2B1C1D1，即菌种比例为∶保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=1∶1，母发酵剂接种量为3%，发酵温度37℃，发酵时间12 h。添加复合稳定剂（CMC0.3%+黄原胶0.01%），均质压力15 MPa～25 MPa，均质温度在30℃～40℃之间，两次均质，效果更好。

3结果与讨论

3.1发酵过程中酸度对稳定性的影响

乳酸菌乳饮料发酵过程中，当pH降至4.6～5.3时，酪蛋白就失去稳定性，酪蛋白粒子发生凝集，分子团变大，最后形成沉淀。整个发酵过程的好坏直接影响酪蛋白颗粒的大小，而乳酸菌乳饮料与酸奶粒子直径的大小有关。

3.2发酵时间和温度对稳定性的影响

发酵时间和温度是影响茎瘤芥乳酸菌饮料稳定性的重要因素之一，温度低，发酵饮料细腻，有利于稳定性的提高。但发酵温度过低，发酵速度过慢，会引起污染，产生异味，导致发酵失败，采用37℃发酵12 h，饮料的安全性和稳定性较好。

3.3菌种比例、种子液接种量对稳定性影响

菌种比例对乳酸菌饮料的稳定性影响较小，乳酸菌种一般含嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，球菌和杆菌的比例大多为1∶1或2∶1，由于杆菌分解蛋白质的活性强，产酸能力也强，使乳酸菌饮料酸度上升过快，牛乳中的结合水就会减少，蛋白质粒子凝集过快，造成发酵乳饮料的组织结构粗糙，颗粒大小不均匀［4］。经过实践证明，球菌与杆菌比例以1∶1更好。

接种量大小直接影响发酵周期。采用较大的接种量可以缩短发酵周期，减少染菌的机会，这是由于种子量多，同时种子液中含有大量体外水解酶类，有利于对基质的利用和产物的合成，并且生产菌迅速占据了整个培养环境，减少了杂菌生长的机会。但是，如果接种量过大，往往使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，稳定性下降，从而影响产物的合成。因此，采用适宜接种量，即可以缩短发酵时间，提高饮料稳定性，同时减少染菌的机会。

［1］徐安书，张洪礼，何军.茎瘤芥胡萝卜混合汁乳酸菌饮料稳定性研究［J］.食品研究与开发，2013，13（34）：62-66

［2］徐安书，胡敏，何军.茎瘤芥叶胡萝卜混合汁复合乳酸菌发酵饮料的研制［J］.食品科学，2012，14（33）：321-325

［3］王善松，丁泉水.乳酸菌饮料稳定性研究［J］.中国乳品工业，2006，34（6）：58-60

［4］张洪颖，秦立虎.乳酸菌乳饮料的不稳定性及其解决对策［J］.乳品工业，2006（6）：52-54

［5］王帅.酸度对发酵奶品质的影响［J］.科技信息、基础理论研究，45-46

Tumorous Stem Mustard Lactic Acid Bacteria Beverage Stability Research and Process Conditions Optimization

XU An-shu1，GUO Jian2，YIN Yong-ling1
（1.Biochemistry Engineering Department，Chongqing Industry&Trade Polytechnic，Chongqing 408000，China；2.Fuling Wahaha Beverage Company Limited，Chongqing 408000，China）

Tumorous stem mustard carrot juice lactic acid bacteria beverage stability study on the basis of the optimization of process conditions based on the further study of the effect of acidity and fermentation process on the sensory quality and organizational status，using four factors and three levels orthogonal experiment to study the effect of proportion，strain，inoculation，fermentation temperature and fermentation time on the stability of the fermentation process，according to the precipitation the size of rate to determine its stability，the results show that：the Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus ratio 1∶1，mother culture inoculation amount 3%，fermentation temperature of 37℃，fermentation time 12 h，homogenization pressure 20 MPa，homogeneous temperature between 30℃-40℃，the better the two homogeneous，effect，finally adding compound stabilizer acid Suo Jiaji cellulose sodium CMC0.3%+0.01%xanthan gum.

tumorous stem mustard；carrot；lactic acid bacteria；stability；process optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.017

2015-02-09

重庆市教委2014年度科学技术研究项目（KJ1403401）

徐安书（1964—），女（汉），教授，学士，研究方向：微生物及微生物发酵技术，食品加工。