龙眼核中多酚提取及抗氧化活性的研究

唐福才，姚敦琛，关天旺，陈亚兰，黄思敏，潘龙，冯艺帆，梁雁，喻丽红，*

（1.广州医科大学第一临床学院，广东广州510182；2.广州医科大学第三临床学院，广东广州510182；3.广州医科大学第二临床学院，广东广州510182；4.广州医科大学药学院，广东广州510182）

龙眼核中多酚提取及抗氧化活性的研究

唐福才1，姚敦琛2，关天旺3，陈亚兰1，黄思敏4，潘龙2，冯艺帆4，梁雁1，喻丽红4，*

（1.广州医科大学第一临床学院，广东广州510182；2.广州医科大学第三临床学院，广东广州510182；3.广州医科大学第二临床学院，广东广州510182；4.广州医科大学药学院，广东广州510182）

采用溶剂萃取、超声辅助萃取和微波辅助萃取提取龙眼核中的多酚，比较萃取率以及其抗氧化活性的差异。分别采用溶剂萃取（回流法和浸提法）、超声辅助萃取和微波辅助萃取提取龙眼核中的多酚，采用Folin-Ciocalteus法测定多酚含量并计算提取率；测定并比较多酚的总抗氧化能力、对羟自由基和DPPH自由基的体外抗氧化能力。不同方法提取多酚含量差异明显，微波、回流、浸提和超声的提取率分别是（13.60±0.46）%、（9.85±0.76）%、（8.65±0.43）%、（12.04±1.69）%。不同方法提取的龙眼核多酚抗氧化活性各样差异，但总抗氧化能力大小差异不明显。龙眼核多酚对·OH清除能力依次为：IC50超声

龙眼核；多酚；超声法；微波法；抗氧化

龙眼核的重量占龙眼果实鲜重的17%，中国是世界龙眼生产大国［1］，全国每年被废弃的龙眼核高达2万t以上。龙眼核中含有多种化合物，包括萜类、脂类、脂肪酸、酚类等，其中多酚类物质含量丰富。Soong和Barlow［2-3］证实龙眼核中含有十三种多酚物质，并发现龙眼核多酚的抗氧化活性与含量呈正比。

多酚即多羟基苯，如苯二酚、苯三酚等，是植物及微生物中产生的酚类次生代谢产物，具有抗氧化、抗凝血、与金属离子的络合等特性［1］。多酚作为天然抗氧化剂，具有抗衰老、抗辐射、清体自由基等功能，对心脑血管疾病的防治，如冠心病、动脉粥样硬化、脑血栓等方面具有良好功效。但目前，管理的不合理、体系的不完善、工艺的落后等对龙眼核多酚的发展仍然有着极大的制约。因此，如何能够充分、合理、科学地利用龙眼核，对龙眼核的综合开发与利用具有十分重要的现实意义。

本文采用溶剂萃取、超声辅助萃取和微波辅助萃取提取龙眼核中的多酚，测定不同萃取法提取龙眼核中多酚的含量以及其的总抗氧化能力、对羟自由基和DPPH自由基的体外抗氧化能力的差异。研究不同提取方法得到的多酚抗氧化活性的差别，为龙眼核的废物利用及多酚的提取开辟了新的思路。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

龙眼核：（购于乐购超市，产地高州）无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、没食子酸、酚试剂（均为分析纯，购买于百灵威科技有限公司）、SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市英予华仪器厂；旋转蒸发仪RE-52C：巩仪市予华仪器有限责任公司；微波发生器MAS-Ⅱ：新仪微波化学科技有限公司；KQ-500VDE型三频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；202-1A型电热恒温干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；BS－124S电子天平：SartoriusAG，Sartorius；722S可见分光光度计：上海菁华科技；DFT-250手提式中药粉碎机：贵州三阳包装设备有限公司。

1.2材料预处理

将新鲜的龙眼核放置于60℃的恒温干燥箱中，干燥至恒重。取出后用粉碎机粉碎，过60目筛，装入棕色广口瓶中备用。

1.3方法

1.3.1龙眼核多酚的提取

1.3.1.1微波辅助萃取法

称取龙眼核粗粉2 g，料液比为1∶20，分别加入75%的乙醇溶液，300 W微波3 min取出搅拌均匀后抽滤，收集滤液。提取完成后，取出烧杯慢慢搅拌，放置2 min～3 min后，用真空泵将原料与溶剂减压抽滤分离，滤饼用同样的条件重复提取2次，收集滤液，滤液用旋转蒸发器减压蒸馏回收乙醇，合并滤液，用旋转蒸发器旋干，称量。将龙眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容至50 mL备用。

1.3.1.2超声波辅助萃取法

称取龙眼核粗粉2 g，料液比为1∶20，分别加入75%的乙醇溶液，在超声清洗器功率比99%，温度60℃，提取30 min，取出搅拌均匀后抽滤，收集滤液。用布氏漏斗减压过滤，滤饼用同样的条件重复提取2次，合并滤液，用旋转蒸发器旋干，称量。将龙眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容至50 mL备用。

1.3.1.3乙醇浸提萃取法

称取龙眼核粗粉2 g，料液比为1∶20，分别加入75%的乙醇溶液，在温度60℃的恒温水浴箱中，浸提6 h，取出搅拌均匀后减压过滤，收集滤液。同样的条件重复提取2次，合并滤液，用旋转蒸发器旋干，称量。将龙眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容至50 mL备用。

1.3.1.4乙醇回流萃取法

称取龙眼核粗粉2 g，料液比为1∶20，分别加入75%的乙醇溶液，采用蒸馏回流提取装置，提取4 h，取出搅拌均匀后抽滤，收集滤液。用布氏漏斗减压过滤，滤饼用同样的条件重复提取2次，合并滤液，用旋转蒸发器旋干，称量。将龙眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容50 mL备用。

1.3.2龙眼核多酚提取物的含量测定

1.3.2.1标准曲线的制备

多酚含量采用Folin-Ciocalteus法［4］（简称FC法）测定，以没食子酸为对照品。参照李静等［5］的方法，以标准曲线法测定样品多酚的含量。准确称取300 mg没食子酸，先加入少量蒸馏水待没食子酸完全溶解后，加入蒸馏水定容至500 mL，混合均匀得浓度为0.6 mg/mL的没食子酸标准液。常温下分别移取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL到10 mL比色管，蒸馏水补足2 mL，加入福林酚甲试剂5 mL摇匀，反应10 min后再加入福林乙试剂0.5 mL，振荡后放置在25℃条件下静置30 min，于750 nm［6］下测定吸光度，以没加没食子酸标准液的反应液为空白对照，制作标准曲线。

1.3.2.2龙眼核多酚提取物的含量测定

取龙眼核多酚提取物备用液，参照1.3.2.1方法，配制样品液，在750 nm处测其吸光度。根据标准曲线算出样品浓度，并按下面公式（1）计算提取率。

式中：c为样品的浓度（根据标准曲线算出），（mg/ mL）；v为样品稀释后的体积，mL；n为稀释的倍数；m为粗提取物质量，mg。

1.3.3龙眼核多酚提取物的总抗氧化能力测定

将龙眼核粗提物用75%乙醇稀释，配制浓度为：0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL，采用总抗氧化能力试剂盒测定，以VC为阳性对照，对龙眼核多酚提取物的总抗氧化能力测定。抗氧化能力单位定义为：在37℃下，每分钟每毫升测定液使反应体系吸光度增加0.01为一个总抗氧化能力单位（U/mL）。

1.3.4龙眼核多酚提取物对羟自由基清除能力测定

将龙眼核粗提物用75%乙醇稀释，配制浓度为：0、0.02、0.16、0.24、0.32、0.48 mg/mL和0.64 mg/mL，采用羟自由基测定试剂盒法，以VC为阳性对照，对龙眼核多酚提取物的羟自由基清除能力测定。

1.3.5龙眼核多酚提取物对DPPH·的清除测定［7］

将龙眼核粗提物用75%乙醇稀释，配制浓度为：0、0.001、0.004、0.008、0.012、0.016和0.032 mg/mL的系列质量浓度，各取2 mL分别加入2 mL无水乙醇，在517 nm波长处测定其吸光度（Aj）；另取上述系列浓度的提取液各2 mL，分别加入2×10-4mol/mL DPPH·溶液2 mL，混合均匀，30 min后在同样条件下测定其吸光度（Ai）；并在同样条件下测定2×10-4mol/mLDPPH·溶液的吸光度度（A0），用同样浓度系列的VC溶液作阳性对照。根据公式（2）计算龙眼核提取液对DPPH·的抑制率。

1.3.6统计学方法

统计学方法：利用SPSS 17统计软件进行方差分析，组间数据比较使用独立样本t检验，（使用SPSS17软件对数据进行统计学分析。测定结果以平均数±标准差（±s）表示，显著性检验为t检验，显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。

2结果

2.1龙眼核多酚提取物的含量测定

按1.2.1的方法制作没食子酸标准曲线。得到的回归方程为y=5.264 3x+0.020 8，R2=0.982 3，在1 μg/mL～7 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。本实验分别采用微波萃取法、超声萃取提法、乙醇浸提法和回流法从龙眼核中提取多酚物质，4种方法得到龙眼核多酚含量，提取率分别是（13.60±0.46）%、（9.85±0.76）%、（8.65±0.43）%、（12.04±1.69）%。微波和超声波萃取法提取效果明显优于传统浸提法和回流法，具有统计学意义，p<0.05。

表1　不同方法提取龙眼核多酚得率Table 1The extracted rates of polyphenol from Lengan seeds

2.2龙眼核多酚提取物的总抗氧化能力测定（FRAP法）

还原力的测定可检验化合物是否为良好的电子供应体，它所提供的电子可以使Fe3+还原为Fe2+，从而使体系溶液颜色改变，即反映出体系中氧化还原状态的改变。体系溶液吸光值越大，则表示被测物还原力越强，抗氧化效果越佳。从图1可知，在试验浓度范围内，微波、回流、浸提以及超声提取的多酚的总抗氧化能力分别为：（30.03±3.72）、（35.67±1.61）、（39.75± 4.34）、（38.65±1.61）U/mg，不同方法提取的多酚总抗氧化能力无明显差异，p>0.05。均明显低于VC总抗氧化能力：（200.52±4.21）U/mg。

图1　龙眼核多酚的总抗氧化能力Fig.1Total antioxidant capacity of polyphenol from Lengan seeds

2.3龙眼核多酚提取物对羟自由基清除能力测定

·OH是活性氧中最活泼的氧自由基之一，它几乎能与活细胞中任何分子发生反应，可介导机体组织脂质过氧化，蛋白质解聚、聚合，核酸断裂和多糖裂解等生化过程，引发组织细胞病变、导致各种疾病发生、加速机体衰老。减少此类自由基可预防衰老、心血管疾病等，并具有防癌抗癌的作用。

不同方法提取的龙眼核多酚对·OH清除能力如图2所示。

不同方法提取的龙眼核多酚对·OH表现出良好地清除能力，IC50VC＜IC50超声＜IC50微波

图2　龙眼核多酚提取物对·OH清除能力Fig.2Scavenging effect of polyphenol from Lengan seeds on hydroxyl radical

2.4龙眼核多酚提取物对DPPH·的清除测定

DPPH·自由基是一种合成的有机自由基，常用来研究酚类抗氧化剂的构效关系，是近年来受到国内外普遍重视的一种分析抗氧化活性的方法。它是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在波长517 nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供1个电子与DPPH的孤对电子配对而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在波长517 nm处的吸光度变小，其变化程度与DPPH自由基清除程度呈线性关系。

表2　龙眼核多酚提取物对DPPH·的清除能力Table 2Scavenging effect of polyphenol from Lengan seeds on DPPH radical

由表2可知，四种方法提取的多酚对DPPH自由基具有良好的清除能力，微波、超声浸提以及回流提取的多酚清除DPPH自由基的IC50分别为0.007 87± 0.000 372、0.009 68±0.000 614、0.010 7±0.000 261、0.007 92±0.000 301。在实验浓度范围内对羟自由基的清除作用呈现出良好的浓度效应关系，并且浓度越大，龙眼核多酚的清除DPPH自由基能力呈上升趋势，并逐渐达到饱和状态，变化也逐渐趋于缓慢。

3结论与讨论

本实验采取微波、超声、浸提和回流提取龙眼核中多酚，结果显示，微波萃取法较超声萃取法提取效果好，微波和超声波萃取法提取效果明显优于传统浸提法和回流法，即W微波>W超声>W回流>W乙醇。其原因可能在于微波提取过程中，微波辐射导致植物细胞内的极性物质吸收微波能，产生大量热量，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化所产生的压力在细胞膜和细胞壁上形成微小孔洞，使胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放出胞内物质，并且由于多酚具有一定的极性，便在微波电磁场作用下产生瞬时极化，从而产生键的振动、撕裂和粒子之间的相互摩擦、碰撞，促进分子活性部分（极性部分）更好地接触和反应［8-9］。这一方法有效的减少了植物多酚在高温环境下的氧化，提高了植物多酚的提取质量，且短时微波提取对植物多酚几乎没有破坏。该方法提取龙眼核多酚提取率最高。超声波产生的机械效应和物化作用打破植物细胞壁，并利用超声的清洗作用加快细胞内含物的释放，提高了提取效率，缩短了时间，避免了高温对提取成分的影响，但纯度不高，故该方法龙眼核多酚提取率次于微波法。作为传统提取方法，回流和浸提法提取周期较长，提取率较低，溶剂极性、溶剂pH、料液比、提取温度均会影响多酚活性和多酚提取率。

同时，试验通过测量总抗氧化能力、清除DPPH能力和羟基自由基能力来评价龙眼核多酚的抗氧化作用。实验结果提示，四种方法提取所得龙眼核多酚均有较好的体外抗氧化能力。其作用机理可能在于多酚类化合物酚羟基中的邻位酚羟基极易被氧化，且对活性氧等自由基有较强的捕捉能力，使其具有较强的抗氧化性和清除自由基的能力［10］。但四种方法的实验结果存在较大差异。不同方法提取的多酚总抗氧化能力无明显差异。龙眼核多酚对·OH清除能力为：龙眼核多酚对DPPH清除能力为：不同方法提取龙眼核多酚的抗氧化能力存在差异。这可能是因为实验过程的差异及与上述方法评价抗氧化活性的机制造成［11］。因此，需同时结合此四种方法对龙眼核多酚抗氧化作用进行客观、全面评价。通过综合评估，微波提取龙眼核多酚抗氧化效果最佳，能有效的清除羟自由基和DPPH自由基，在一定范围内清除自由基能力和浓度成线性关系。

综上，龙眼核多酚可作为抗氧化物质潜在资源，不同提取方法龙眼核多酚抗氧化能力具有差异，具有较高的应用价值和经济效益。本文为下一步深入研究龙眼核的抗氧化作用的物质基础提供参考，并为龙眼核多酚资源的充分利用奠定基础。

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Study of the Extraction and Antioxidant Capactity of Ployphenol from Longan Seeds

TANG Fu-cai1，YAO Dun-chen2，GUAN Tian-wang3，CHEN Ya-lan1，HUANG Si-min4，PAN Long2，FENG Yi-fan4，LIANG Yan1，YU Li-hong4，*
（1.The First Clinical College of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China；2.The Third Clinical College of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China；3.The Second Clinical College of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China；4.The Medicine college of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China）

Polyphenols were extracted from longan seeds by using solvent extraction，ultrasound-assisted extraction and microwave-assisted extraction respectively.The content of polyphenols was detemined by the Folin-Ciocalteus method，and the extracted rates were calculated.The antioxidant activity of extracts were evaluated by total reducing power，superoxide anion radical and DPPH free radical scavenging activities.The extracted rates of polyphenol were（13.60±0.46）%，（9.85±0.76）%，（8.65±0.43）%，（12.04±1.69）% respectively.It was revealed that there were significant differences among these methods.The most radical scavenging activity against superoxide anion radical and DPPH free radical was microwave-assisted extract.In conclusion，the best result was obtained from microwave-assisted extraction.It was a linear relationship between concentrations and free radical scavenging abilities within a certain range.

longan seed；ployphenol；ultrasonic；microwave；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.002

2015-01-03

2012-2013年度广州医科大学大学生科技创新项目2013A0008；2014年国家级大学生创新创业训练计划项目201410570014；2015年度广东大学生科技创新培训专项资金立项项目

唐福才（1991—），男（汉），在读本科生，从事天然药物、心血管方向研究。

喻丽红，女（汉），实验员，主要从事药物化学的研究工作。