肺复方对Lewis肺癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用及抗血管生成的机制研究

章 慧，沈慧芸，王亿君

肺复方对Lewis肺癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用及抗血管生成的机制研究

章 慧，沈慧芸，王亿君

（湖南省肿瘤医院，长沙 410081）

目的：研究肺复方对裸鼠肺癌移植瘤的抑瘤作用，探讨肺复方的抗血管生成作用机制。方法：将40只裸鼠随机分空白对照组（NS组），其余32只待造模后随机分为模型组（MX组）、恩度组（ED组）、肺复方大剂量组（FD组）、肺复方小剂量组（FX组）。观察肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线和抑瘤率曲线。HE染色下进行了病理形态学观察。取肿瘤组织免疫组化检测MVD。Western Blot方法检测VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF。结果：与肿瘤模型组比较，各用药组肺癌移植瘤生长均出现程度不一的减慢，肿瘤细胞出现凋亡坏死。抑瘤率从高到低：恩度组＞肺复方大剂量组＞肺复方小剂量组＞模型组。各组平均灰度值与血管数目表现为：模型组＞小剂量组＞大剂量组＞恩度组。与模型组比较，其他各组的VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白表达均有不同程度下降，其中恩度组最为明显，除bFGF的表达大剂量组与小剂量组无差别，其余三种蛋白的表达均表现为：模型组＞小剂量组＞大剂量组＞恩度组。结论：黎月恒老师治疗肺癌的协定处方肺复方能在一定程度上减慢肿瘤的生长，其抗肿瘤的作用可能与抑制了血管生成的正性调控因子VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF的表达有关。

肺复方；抗肿瘤；抗血管生成；Levis肺癌细胞

原发性支气管肺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤［1-2］，随着发病率的逐年提高，肺癌已超过癌症死因的20%［3］。其中非小细胞肺癌发病率约占肺癌发病总数的80%［4］。2012年全球新增肺癌病例180万，死亡人数159万，占癌症死亡总数的19.4%，其中高出1/3的病例出现在中国，约2/3的肺癌患者确诊时已经出现远处转移，失去手术机会［5］，如不予抗肿瘤治疗，平均生存期为4～5个月［6］。因此探讨肺癌的发生发展机制和治疗的有效方法具有重要性。“养阴清解”法是黎月恒老师治疗肺癌的重要的学术思想，根据该治法拟定了肺复方。通过运用该方治疗气阴两虚、邪毒内蕴型非小细胞肺癌的临床研究，显示此方在稳定瘤体、减轻化疗毒副作用、改善患者临床症状和生活质量、提高免疫力等方面均显示出较好疗效［7-21］。本课题在临床研究的基础上，建立Lewis肺癌裸鼠移植瘤模型，通过肿瘤生长曲线和抑瘤效果观察，HE染色检测移植瘤的病理变化，免疫组化检测微血管密度（microvessel density，MVD），Western Blot检测血管生成相关因子VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白的变化，拟通过体内观察肺复方对Lewis肺癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用，研究其抗血管生成的机制，为肺复方的临床应用提供实验室依据。

1　资料与方法

1.1细胞株 Lewis鼠源性肺腺癌细胞，购于ATCC细胞库。

1.2实验动物 BALB/C裸鼠40只，雌雄各半，6～8周龄，体重18～22克。裸鼠均购于湖南斯莱克公司。

1.3主要实验药品、分组和用药 肺复方：百合10g、麦冬10g、熟地10g、生地10g、玄参10g、当归10g、白芍10g、沙参15g、桑白皮15g、黄芩15g、蚤休15g、臭牡丹15g、蛇舌草15g，购于湖南省肿瘤医院，经过湖南中医药大学药学专家周日宝鉴定。水煎醇沉为25 mL，大剂量组每毫升含生药6.2g，小剂量组每毫升含生药2.05g，大、小剂量组每毫升含生药为3：1。无菌4℃保存。恩度：15 mg/支，山东先声麦得津生物制药有限公司出品，产品批号：国药淮字S20050088。稀释为浓度0.2 mg/mL。

先将40只裸鼠按照随机数字法随机分出8只空白对照组（NS组），其余32只待出瘤后（造模后第7天）按随机数字法分为模型组（MX组）、恩度组（ED组）、肺复方大剂量组（FD组）、肺复方小剂量组（FX组）。空白对照组：一般处理，常规给予食物、水；模型组：取蒸馏水0.2mL灌胃；恩度组：每次0.2 mL（恩度浓度0.2mg/mL）腹腔注射；肺复方大剂量组：每次灌胃0.2 mL（肺复方浓度6.2g/mL）；肺复方小剂量组：每次灌胃0.2 mL（肺复方浓度2.05g/mL）。除空白对照组，每组灌胃或腹腔注射均为每日上午9点一次，用药14天。

1.4主要试剂与仪器 DMEM培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；苏木素-伊红染色液（上海沪峰生物科技有限公司）；免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司）；恒温水浴箱（Heto公司）；超净工作台（上海旦鼎公司）；细胞培养箱（Thermo，美国）；光学显微镜（日本Nikon公司）；WB一抗：VEGF、VEGFR2、Ang-2（abcam Company，USA）；WB一抗：bFGF、GAPDH（Santa Company，USA）；WB二抗（Sigma，USA）。

1.5实验方法

1.5.1建立皮下移植瘤小鼠模型 复苏后的Lewis小鼠源性肺腺癌细胞制成浓度1×107/mL细胞悬液分装入培养基内，在37℃和5%CO2的条件下传代培养。收集生长达80%左右的肺腺癌细胞，调整细胞悬液浓度至1× 107/mL。于小鼠后臀部，皮下注射约0.2mL细胞悬液。

1.5.2观察指标

1.5.2.1常规指标监测 定期观察裸鼠一般情况，如精神，饮食，睡眠，大小便，毛发光泽，活跃程度，给药后第7、9、11、13、15、17、19、21天分别用游标卡尺测量荷瘤裸鼠肿瘤长（a）短径（b），计算瘤体积（公式：V（mm3）=ab2π/6）。然后颈椎脱揪法处死老鼠，剥离肿瘤，称瘤重量，计算肿瘤生长抑制率，绘制肿瘤生长抑制率图。肿瘤生长抑制率（%）=（模型组肿瘤质量-实验组肿瘤质量）/模型组肿瘤质量×100%。

2.2.2病理形态学观察 适量肿瘤组织制成石蜡切片，切片厚度3～5 μm，经HE染色后观察标本病理改变。

2.2.3免疫组化检测MVD 适当肿瘤组织制成石蜡切片，切片厚度3μm，用CD34免疫组化染色。

2.2.4Western Blot方法检测VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF的蛋白含量 常规方法提取各组0.5mg组织总蛋白，行SDS-PAGE电泳，转膜，用5%的脱脂奶粉（PBS配制）在37℃恒温下封闭2h。一抗为VEGF（42KD，稀释度1：1000）、VEGFR2（200KD，稀释度1：500）、Ang-2（57KD，稀释度1：500）、bFGF（24KD，稀释度1：1000）、GAPDH（37KD，稀释度1：500）。二抗为酶标，加ECL发光底物试剂，得到胶片。

2.3统计方法 所有数据使用SPSS19.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示多组样本均数间比较，符合方差齐性用单因素方差分析，不符合方差齐性用秩和检验。

2　结果

2.1一般情况 肺癌裸鼠移植瘤模型建立后，各组裸鼠一般情况基本正常，其中空白对照组裸鼠精神状态好，反应敏捷，皮肤红润有光泽，体重正常增加，无死亡。而其他小鼠精神状态欠佳，反应较迟钝，皮肤欠红润、光泽，体重增加较缓，无死亡，且造模后最早在第5天皮下部位出现小米粒大小的红色小硬结，所有造模小鼠最迟第7天出现皮下部位的红色小硬结，成瘤率100%，肿瘤出现后迅速生长，其中以模型组肿瘤生长最快，压迫症状最明显，其余各组肿瘤生长速度明显减慢。

2.2根据各组肺癌裸鼠移植瘤的生长情况绘制曲线各组小鼠移植瘤体积变化曲线见图1。

图1　各组裸鼠肿瘤生长曲线

由图1可见，与肿瘤模型组比较，各用药组肺癌移植瘤生长均出现程度不一的减慢，减慢程度比较恩度组＞肺复方大剂量组＞肺复方小剂量组＞模型组。

2.3肿瘤生长抑制率 各组小鼠移植瘤生长抑制率比较见图2。

图2　肿瘤生长抑制率

由图2可以看出，肺复方大、小剂量组和恩度的抑瘤率分别为：19.46%、8.05%、33.56%。抑瘤率从高到低恩度组＞肺复方大剂量组＞肺复方小剂量组＞模型组。

2.4肿瘤病理形态学结果 从图3可以看出：模型组：肿瘤细胞充满整个视野，肿瘤细胞大，明显可见出现多核，排列不规则；几乎没有观察到凋亡、坏死细胞，伊红染色少即间充质纤维少。恩度组：可见肿瘤细胞出现大量的凋亡坏死；细胞核出现融合裂解，无明显的细胞核形态；大片的伊红染色，坏死细胞被充质纤维填充。肺复方大剂量组：可见细胞核出现融合变圆，胞质皱缩，出现较多细胞凋亡和坏死。肺复方小剂量组：大部分细胞胞体较大，小部分细胞核出现融合变圆，胞质皱缩；少量细胞凋亡和坏死。

2.5肺癌移植瘤微血管密度表达 各组肿瘤组织病理标本经过CD34染色，肿瘤组织间质血管均有染色，各组微血管的大小，形态，数目有较大差异（见表1及图4）。从表1及图4可以看出，模型组微血管密度即平均灰值最高，为138.92，模型组的血管数目也最高，为88.13。各组平均灰度值与血管数目表现为：模型组＞小剂量组＞大剂量组＞恩度组（P＜0.01），即对肿瘤组织的微血管生成的抑制作用强弱依次为：恩度组＞大剂量组＞小剂量组＞模型组。

图3　HE染色（×400）

*与模型组比较P＜0.01

图4　IHC染色（×400）

2.6Western Blot结果 从表2及图5可以看到，在肺癌移植瘤组织中，与模型组比较，各组的VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白表达均有不同程度下降，其中恩度组最为明显（P＜0.01），肺复方大、小剂量组与模型组比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）。各组组内比较中，除bFGF的表达大剂量组与小剂量组无差别，其余三种蛋白的表达均表现为：模型组＞小剂量组＞大剂量组＞恩度组（P＜0.01）。

表2　肿瘤组织VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白表达比较（x±s）

图5　VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF蛋白的western-blot条带

3　讨论

1971年，Folkman提出肿瘤的生长和转移依赖于血管新生过程。其主要步骤包括：原发癌灶的生长，肿瘤血管的生成，肿瘤细胞脱落并侵入基底膜，进入脉管系统，导致癌栓形成，继发癌的生长，肿瘤血管生成，转移瘤的继续扩散［22］。通过抑制肿瘤血管形成，减慢肿瘤生长的速度，以及降低肿瘤浸润转移的发生率，是目前抗肿瘤研究的重要方向［23］。

肿瘤血管的生成主要依靠血管生长促进因子和血管生长抑制因子的调控，调控因子分正性调控因子和负性调控因子两大类［24］。主要正性调控因子有：1.血管内皮细胞生长因子（VEGF）；2.碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；3.粘附因子等。主要负性调控因子有：1.肿瘤抑制基因；2.血管生长抑制素AS和内皮生长抑制素ES；3.血小板反应蛋白等。其中正性调控因子研究最多也是最重要的是VEGF及其受体（VEGFR）。有研究认为血清检测VEGF，VEGFR2对肺癌患者的诊断具有普遍性，可以作为诊断检测方法之一［25］。Mochizukil最新研究证明：在成熟组织和培养的内皮细胞中Ang2有促进血管生成作用［26］。有大量研究表明Ang2跟VEGF具有协同作用，共同促进肿瘤血管的生成［27］。bFGF在体内和体外均能明显促进血管形成，可直接刺激血管内皮细胞释放基底膜降解酶，并可趋化血管内膜的各类细胞并促进其增殖和迁移［28］。MVD被认为是最理想的反映肿瘤血管生成情况的指标，大多数研究认为MVD值高是预后不佳的指标。

肺复方具有益气养阴、化痰散瘀、清热解毒、软坚散结、攻补兼施之效。本实验肺复方表现出对肺癌移植瘤的抑制作用，虽不及恩度组明显，但是仍具有一定的意义，黎月恒老师治疗肺癌的协定处方肺复方对肺癌移植瘤能在一定程度上减慢肿瘤的生长，其抗肿瘤的作用可能跟抑制了血管生成的正性调控因子VEGF、VEGFR2、Ang-2、bFGF的表达有关，但本研究对抑制血管生成的过程中确切的作用机制尚不完全明确，需要进一步探讨。

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Study of Inhibitory Effect of Lung Compound on Transplanted Lewis Lung Carcinoma Cell in Nude Mice and It's Mechanism of Anti-angiogenesis

Zhang Hui， Shen Hui-yun， Wang Yi-jun
（Hunan Caucer Hospital， Changsha 410013， China）

Objective Researched the influence of the Fei Fufang for nude mouse lung transplantation tumor， Explore the mechanism of the Fei Fufang. Methods Random points 8 from 40 nude mice as the blank control group （NS）， the rest of the 32 only after building were randomly divided into the model group （MX）， the degree group （ED）， the Fei Fufang high-dose group （FD）and the Fei Fufang low-dose group （FX）. Observing the tumor size， tumor growth curve drawing. To observe the pathological morphology under the HE dyed.Take the tumor tissue to detect the MVD （microvascular density）， Take the tumor tissue to detect VEGF， VEGFR2， Ang-2 and bFGF by Western Blot method. Results Compared with tumor model group， the treatment group lung transplantation tumor growth slow in varying degrees， visible tumor cell necrosis appeared apoptosis. Inhibitory rate fromhigh to low：Endostar group＞High dose group＞small dose group＞control group. For each group， mean gray values and amount of blood vessels showing that：control group＞small dose group＞High dose group＞Endostar group. Compared with model group，there shows different degrees of decline in protein expression of other groups' VEGF ，VEGFR2， Ang-2 and bFGF， among which endostar group reduced most dramatically with statistical meanings.There was no difference in the expression of bFGF between high-dose group and small dose group，nevertheless，the rest of the three kinds of protein expression intensity arrangements were as follows：model group ＞ High dose group＞ small dose group＞Endostar group. Conclusion Agreement prescription Fei Fufang of Professor LiYueheng slow down the growth of the tumor to a certain extent.Its anti tumor effect may be related to the inhibition of the expression of the positive regulation factors VEGF， VEGFR2， Ang-2 and bFGF of angiogenesis. Inhibition of angiogenesis may also be one of the mechanisms of Fei Fufang prevention and treatment of recurrence and metastasis of lung cancer.

Fei fufang； anti-tumor； anti-angiogenesis； levis lung cancer cells.

R979.1

A

1673-016X（2015）06-0111-05

2015-02-02

章慧，E-mail:382793382@qq.com