气质联用法检测水产品中己烯雌酚含量并用液相色谱串联质谱验证

魏斌 陆井莲 魏云计 张科 朱臻怡 柏爱旭 冯民 王小晋

（淮安出入境检验检疫局 江苏淮安 223001）

气质联用法检测水产品中己烯雌酚含量并用液相色谱串联质谱验证

魏斌 陆井莲 魏云计 张科 朱臻怡 柏爱旭 冯民 王小晋

（淮安出入境检验检疫局 江苏淮安 223001）

改进了水产品中己烯雌酚的检测方法。样品用乙酸乙酯提取，HLB固相萃取柱净化，BSTFA-TMCS吡啶溶液80°C衍生；经过HP-5MS（30m×0.25mm，0.25 μm）毛细色谱柱分离，再经过单四级杆质谱仪选择离子扫描（m/z：383、397、412、413）确定两种结构的衍生物，用气质联用仪检测其衍生物从而间接检测己烯雌酚。以反式衍生物做定量物质，在5-180 μg/kg浓度范围获得良好线性（R=0.995）；3个添加浓度（1、2、5 μg/kg）下的平均回收率为90.15%-92.82%，标准偏差为6.7%-9.3%。阳性样品经过乙酸乙酯提取后吹干，HLB固相萃取柱净化，甲醇定容后，用配备RBAX SB-C18柱（2.1×150mm，3.5 μm）的高分辨率液相色谱串联质谱仪进行验证，确保检测的可靠性。

己烯雌酚；水产品；气质联用；液相色谱串联质谱；衍生化

1 前言

己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）为人工合成的雌性激素，纯的DES为无色晶体或白色晶体粉末，易溶于乙醇、氯仿、乙醚、油类以及强碱性溶液，难溶于水，曾用于临床上一些妇科疾病的治疗和养殖业用于促进动物生长，但是其对人体和动物的危害也日益凸显。上世纪60年代，世界各国已经开始在动物饲料中禁止添加，在水产品中规定不得检出［1］。2002年，我国农业部发布公告，DES及其盐、酯制剂停止在食用动物中使用，第235号公告规定在动物性食品中不得检出，第1163号公告规定在水产品中不得检出［2］。

目前对于水产品DES的检测有ELISA法、HPLC法、GC-MS法和LC-MS/MS法［3］。HPLC法的检测限高达250 μg/kg［4］，显然不符合相关公告中不得检出的要求；而ELISA法虽然检测限比较低，但只能作为一种筛选方法；另外LC-MS/MS法也可以作为DES的检测方法且无需衍生，但一方面与之相对应的国家标准GB/T 22963-2008只将测量范围局限于河豚鱼和鳗鱼，所以此法也不能广泛用于水产品中DES的检测，另一方面LC-MS/MS仪器昂贵，检测成本较高，不适合大规模的筛查检测。农业部1163号公告-9-2009所规定的气质联用法一直是广大水产品检测实验室检测、出证的主要依据，本项目参考此方法并用液相串联质谱对阳性样品加以验证，使水产品中DES的检测更为方便、经济并且有依据［5-8］。

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1试验样品

银鱼样品：超市购买。

2.1.2试剂

甲醇、正己烷、吡啶：色谱级，德国Merck公司；乙酸乙酯：分析纯，南京化学试剂有限公司；无水碳酸钠：分析纯，上海国药集团；衍生化试剂（BSTFA：TMCS=99：1）：美国REGI公司；DES标准品：德国Dr.Ehrenstorfer公司。

2.1.3主要仪器

气相色谱-质谱联用仪：Thermo Trace-DSQII，配有EI离子源，美国Thermo Fisher公司；电子天平：PB-203E型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；恒温氮吹装置：N-EVAP14165型，美国Organomation联合公司；Thermo Finngan TSQ QuantumUltra ENR串联质谱仪：美国Thermo Fisher公司；进样瓶兼反应瓶：2 mL，33号透明硼硅酸盐玻璃带蓝色改性硅树脂密封圈，美国Thermo Fisher公司。

2.2方法

2.2.1气相色谱-质谱条件

色谱柱：HP-5MS弹性石英键合毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始柱温130°C保持1 min，以20°C/min升到180°C保持10 min，再以3°C/min升到230°C保持4min，再以30°C/min升到280°C保持2 min；进样口温度：250°C；载气：高纯氦气；流速：1.0 mL/min；不分流进样：1 μL；样品抽吸次数（plunger strokes）：设为10；进样口内含硅烷化玻璃棉不分流进样衬托管。质谱部分离子源温度：230°C；接口温度：280°C；选择离子模式；DES正反式衍生物监控离子均为：383、397、412、413。

2.2.2样品处理

（1）粉碎

银鱼鱼肉样品经粉碎机粉碎均匀。

（2）提取

称取5 g试样（精确到0.01 g）置于50 mL具塞塑料离心管中，加入10%碳酸钠溶液3 mL，加入乙酸乙酯15 mL，涡旋1 min后6000 r/min离心10 min。取上层乙酸乙酯溶液于100 mL梨形瓶中，再加入15 mL乙酸乙酯重复提取1次，合并2次乙酸乙酯提取液。40℃下旋转蒸发至干，用1 mL正己烷溶液溶解残留物，待净化。

（3）净化

依次用5 mL正己烷、5 mL乙酸乙酯活化HLB固相萃取柱，取待净化液过柱，控制流速不超过2 mL/min，用1 mL正己烷再洗涤梨形瓶，洗涤液过柱。抽干小柱，乙酸乙酯10 mL分3次洗脱小柱，控制洗脱速度小于1滴/s。收集洗脱液于10 mL氮吹管中在50℃下吹干，用1 mL无水乙醚溶解残留物，再用1 mL无水乙醚洗涤氮吹管，合并2次溶液到2 mL反应瓶中并吹干。

（4）衍生化

将上述吹干后的反应瓶中加入100 μL吡啶、50 μL衍生化试剂后拧紧密封盖，涡旋混匀，加入到80℃烘箱中衍生反应30 min。等冷却后40℃水浴下氮吹干，用0.5 mL正己烷定容，漩涡混合后GC-MS上机检测。

3 结果与讨论

3.1提取与净化方法

选择二氯甲烷、氯仿、乙醚和乙腈几种常见有机溶剂对银鱼样品进行提取，结果显示经二氯甲烷提取的回收率较低（＜80%）；氯仿和乙醚提取的回收率均在80%以上，但蛋白质及脂类较多，不利于后一步净化；乙酸乙酯提取的回收率在80%以上且稳定，所溶脂类较少，有利于净化，因此选用乙酸乙酯作为提取液。在提取时加入10%的碳酸钠溶液后，回收率可达90%且能有效降低干扰。

根据DES的结构特点选择SLH、HLB、C18和石墨碳黑氨基柱进行净化对比试验，结果显示使用C18柱和石墨碳黑氨基柱的回收率低于50%且淋洗溶剂剂用量较大；SLH柱和HLB柱回收率均可以达到90%以上，但SLH柱在稳定性上不如HLB柱，因此选择HLB柱。分别用正己烷、正己烷：乙酸乙酯（85：15）和乙酸乙酯对HLB柱进行洗脱实验，发现乙酸乙酯洗脱效果最好，在10mL洗脱液可达到回收率最大化。

3.2定性方法

DES沸点为407℃，已经超过色谱柱的极限温度（315℃），并且酚羟基有极大的极性，会吸附在色谱柱上造成仪器污染，故需要衍生化反应生成沸点低的硅烷化衍生物，其衍生物EI离子源全扫质谱见图1。

图1　DES衍生物总离子MS谱图（经NIST数据库搜索确定结构）

m/z 73和m/z 207为硅化合物的碎片，残留衍生剂也会有此类碎片，故排除此2项。选择DES部分碎片的离子进行监控，分别为m/z 383（25%）、m/z 397（25%）、m/z 412（45%）、m/z 413（100%）。其中，m/z 413和m/z 412为衍生物的母离子，m/z 397为失去一个甲基的离子碎片，m/z 383为失去二个甲基的离子碎片。标准液在SIM模式下的色谱图见图2。

图2　10μg/kg浓度的标准液SIM模式下色谱图

3.3定量方法

DES具有顺反异构体，药用DES为反式，但是在标准品中会有极少量顺式结构，提取过程和衍生化中也会有顺式异构体产生，将顺式和反式异构体加起来方可定量准确。建立5、10、50、80、180 μg/kg标准溶液组上机操作，结果显示顺式衍生物线性较差，反式衍生物线性可满足一般定量要求（R= 0.995）；如果将两者峰面积相加，则能得到较为良好的线性关系（R＞0.999），见图3。但是实际操作中，大多数仪器公司所配分析软件版本均无法实现把距离较远的两个峰面积进行相加并线性拟合，如每次都导出数据再导入专业计算软件进行拟合计算则较为费时费力，在实际大批量检测操作中很难实现。因此用反式衍生物定量即可满足检测需要，因DES规定不得检出，只检测顺式衍生物也能满足监控需要［9］。

图3　DES顺反式衍生物面积之和与浓度的线性关系

3.4回收率、精密度和定量限

根据相关法律法规，DES为不得检出，定量限为0.5 μg/kg，图4即为添加定量限浓度的色谱图。对于单四级杆的仪器联用仪，可以根据离子碎片的相对丰度排除基质的干扰，因此此方法满足要求。对银鱼样品分别添加浓度为1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg的标准品进行添加回收实验，结果见表1。

图4　纯净银鱼样品（上）和添加0.5 μg/kg标准品的银鱼样品（下）色谱图对比

表1　银鱼中DES测定的回收率和精密度

3.5衍生化方法的改进

对于DES这类带羟基基团强极性、高沸点的化合物进行气相色谱和气质联用仪检测的时候，均需要衍生为低极性、易气化的化合物。硅烷化衍生是普遍采用的衍生化方式，BSTFA、TMCS组合衍生化试剂也是最常用的衍生化试剂，也可以用N-甲基-N=三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）［11］。另外也可采用酰基化衍生法，比如采用五氟丙酸酐衍生剂［10］。为了和通行标准一致，本项目只研究BSTFA、TMCS组合衍生化试剂，其反应原理如图5所示。农业部公告中衍生化试剂用100 μL，而从经济性和量取准确性角度考虑，加入50 μL衍生剂比较合适。

图5　本项目中DES的衍生原理

分别取标DES准样品2 μg、5 μg、10 μg、20 μg、50 μg加入50 μL衍生化试剂，加入100 μL吡啶溶液，充分震荡并在80°C衍生30 min，衍生后吹干定容2 mL上机检测，得到良好线性，见图6，说明50 μL衍生剂足够线性浓度范围内的检测要求。但是在氮气吹干后仅仅用50 μL衍生剂会导致与瓶壁残留混合不均匀、衍生效率不高、线性不好等问题，图7为未加吡啶溶剂的衍生效果，线性相关系数只有0.990。如果用100 μL吡啶做溶剂，则可以避免此弊端从而获得良好线性。但衍生完全后，需要将吡啶吹干后再定容上机，以避免吡啶和衍生剂对毛细管色谱柱造成的损伤。

图6　50μL衍生剂与2-50 μg DES反应所得线性

3.6液相色谱串联质谱的验证

衍生在外标法检测不得检出的样品时存在一些不确定因素和检测及监管上的风险。除了做平行和添加回收以外，很多有条件的实验室也采用液相色谱串联质谱对阳性样品进行验证以及排除假阳性。

3.6.1仪器工作条件

色谱条件：RBAX SB-C18柱（2.1×150 mm，3.5 μm）；流动相：A为甲醇，B为H2O；洗脱程序：0-3 min时A由70%线性降至10%并保持4.4 min，7.5 min-10 min时A线性升至70%并保持2.5 min；流量：0.25 mL/min；进样量：25 μL；柱温：35℃。质谱条件：电喷雾负离子源，负离子扫描方式；离子源温度：110℃；洗脱氮气流量：700 L/h；洗脱剂气温度：350℃；电离电压：2.8 kV；母离子：267eV；子离子和碰撞气能量分别为：222m/z（36eV），237m/z（29eV），251 m/z（27ev）。

3.6.2样品处理

将5.0 g样品均匀粉碎后加入50 mL离心管中，加入100 g/L的碳酸钠溶液3 mL、乙酸乙酯15 mL，涡旋30 s，超声提取15 min，离心后取上清液于梨子形瓶中；同样方法提取残渣1次；合并乙酸乙酯提取液，40℃旋转蒸发至干，用1 mL甲醇溶解残留物，净化方法与气质方法相同。洗脱液吹干后用1 mL 20%的甲醇水溶液溶解残留物，过0.22 μm滤膜后无需衍生直接上机检测。

3.6.3验证讨论

建立2-1000 μg/kg浓度范围内共7个点的标准序列，线性关系良好，相关系数R2为0.9998，说明在不衍生的条件下液相色谱串联质谱对DES在较大的浓度范围具有良好的线性响应。银鱼空白样和加标0.2 μg/kg的样品对比如图8，说明此方法具有较好的灵敏度，适合做为气质方法的补充，来验证DES。

图8　空白样品（上）与添加0.2 μg/kg样品（下）的液相串联质谱谱图

4 结论

本项目建立的DES气相色谱质谱检测法，灵敏、可靠、检测范围广、相对成本低。同时用液相色谱-串联质谱仪对阳性样品进行验证，使实验结果更加可靠，排除假阳性。衍生法配合内标法使用气质联用仪检测更加具有可靠性和说服性，寻找一个廉价可靠的内标物是今后工作的一个重点。

［1］朱文嘉，王联珠，郭莹莹，等.国内外鱼类产品兽药残留限量标准对比分析［J］.水产科技情报，2013，40（5）：225-231.

［2］陈眷华，王文博，徐在品，等.己烯雌酚残留的三种检测方法比较［J］.食品科学，2006，27（09）：214-218.

［3］李龙飞，赵晓磊，何金兴.牛奶中雌激素残留检测方法研究进展［J］.乳业科学与技术，2013，36（3）：24-27.

［4］宫向红，徐英江，张秀珍，等.气相色谱-质谱法测定水产品中的己烯雌酚［J］.食品科学，2009，30（02）：168-169.

［5］Liu S F，Xie Z H，Wu X P.Separation of Structurally Relaated EstrogensUsingIsocraticElutionPressurizedCapillary Electrochromatography［J］.J Chromatogr A，2005，1092：258-262.

［6］Ankley G T，Bencic D C，Breen M S.Developing exposure indicators and predictive models of effects based on mechanism of action［J］.Aquatic Toxicology，2009，92（3）：168-178.

［7］Rhee J S，Kim R O，Seo J S.Bisphenol A modulates expression of gonadotropin subunit genes in the hermaohroditic fish［J］. Comparative Biochemistry and Physiology Part C，2010，152（4）：456-466.

［8］Newbold R R，Padilla-Banks E，Jefferson W N.Adverse effects of the model environmental estrogen diethylstilbestrol are transmitted to subsequent generations［J］.Endocrinology，2006，147（6）：11-17.

［9］何方洋，万宇平，罗晓琴，等.己烯雌酚残留检测方法的研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2011，10（上）：76-78.

［10］李强，赵炜，蔡立鹏，等.气相色谱-串联质谱测定乳粉中6种雌激素乳业科学与技术［J］.2013，36（6）：18-20.

［11］廖涛，吴晓翠，王少华，等.固相萃取-气相色谱/质谱联用法同时检测水体中9种环境雌激素［J］.分析化学研究简报，2013，41：422-425.

Determination of Diethylstilbestol Residue in Aquatic Products by GC-MS and Verification by LC-MS/MS

Wei Bin，Lu Jinglian，Wei Yunji，Zhang Ke，Zhu Zhenyi，Bai Aixu，Feng Min，Wang Xiaojin
（Huaian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huaian，Jiangsu，223001）

A economical analytical method by chromatograph-mass spectrometer was developed for the diethylstilbestrol（DES）in aquatic products.The samples were extracted with acetic ether，purified by HLB extraction column，and get derivative reaction with BSTFA-TMCS in pyridines at 80°C.The extract was separated on an agilent HP-5MS capillary column（30m×0.25mm，0.25 μm）and detected with high resolution mass spectrometry in SIM mode（m/z：383，397，412，413）.There ware two derivative compounds，Cis-DES-（OTMS）2 and Trans-DES-（OTMS）2 displayed by chromatogram and the Trans-DES-（OTMS）2 was the quantitative compound for DES.The results showed that high correlation coefficients（R=0.995）were obtained within their respective linear ranges when have a range of 5-180 μg/kg.The average recoveries for 1 μg/kg，2 μg/kg，5 μg/kg spiked levels ranged from 90.15%to 92.82%with RSDs of 6.7% -9.3%.The positive samples were verified by LC-MS/MS with RBAX SB-C18 column for higher reliability.

Diethylstilbestrol；Aquatic Products；GC-MS；LC-MS/MS；Derivative Action

C931.2

E-mail：seuwei@126.com

2014-09-18