细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾专家共识

栾佐

·指南与共识·

细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾专家共识

栾佐

一、概述

小儿严重脑损伤及神经残疾是指一系列由多种原因引发的、常规方法很难获得疗效的重度脑损伤及其后遗症，大致分为中-重度围产期脑损伤、中-重度急性缺氧（缺血）脑损伤、中-重度中枢神经残疾、难治性自身免疫相关性脑病及代谢性脑病等。据不完全统计，目前我国足月新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy， HIE）的发病率为3‰～5‰，早产儿脑白质损伤发病率为10%～17%，儿童脑性瘫痪发病率为1.5‰～ 4‰，孤独症谱系障碍发病率达1%，智力发育障碍发病率也高达2%～3%，很有必要探索小儿严重脑损伤及神经残疾新的治疗方法。

基础研究提示干（祖）细胞移植治疗中枢神经系统疾病的机制主要有以下几个方面：（1）细胞替代效应：植入细胞增殖、分化为神经元和胶质细胞并与宿主整合，产生轴突并髓鞘化，形成神经突触与回路［1-4］；（2）细胞旁分泌的因子效应：植入细胞分泌各类因子，抑制宿主神经细胞凋亡并促进轴突再生，促进血管再生和宿主神经干细胞增殖与分化，激活静息突触，抑制局部免疫反应和胶质瘢痕形成［5-7］；（3）造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation， HSCT）通过免疫重建诱导宿主免疫耐受，纠正自身免疫性脑损伤，通过替代宿主血液细胞和细胞交叉纠正反应纠正代谢性脑病患儿宿主血液及脑内相关酶水平，减少相应代谢底物堆积导致的神经细胞毒性，恢复相应代谢产物的生理功能［8-10］。HSCT治疗遗传代谢病及自身免疫性脑病已有数十年历史，其他干（祖）细胞移植治疗神经系统疾病的临床研究也已走过十余年历程。国内外不乏胚胎干细胞（embryonic stem cell， ESC）、神经干（祖）细胞（neural stem/progenitor cell， NS/PC）、间充质干细胞 （mesenchymal stem cell， MSC）、造血干细胞（hematopoietic stem cell， HSC）、单个核细胞（mononuclear cell， MNC）、嗅鞘细胞（olfactoryensheathing cell，OEC）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells， iPS） 以及干细胞衍生物治疗神经系统疾病报道研究［11-19］。我国海军总医院儿科2005年在国际上率先开展了神经前体细胞移植治疗小儿脑损伤并取得一定疗效［19］。目前国际上已注册百余项干细胞移植治疗脑损伤的临床试验研究，其中小儿脑损伤的干细胞移植治疗研究有近50项，覆盖新生儿HIE、脑性瘫痪、孤独症谱系障碍、脑创伤、佩—梅病（Pelizaeus-Merzbaeher disease， PMD）和Batten代谢性脑病等多个病种，所采用的细胞有自体或异体MSC、MNC、NS/PC及OEC等。众多临床试验结果表明细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾安全有效［19-22］，部分患儿在智力、运动、肌肉张力、视觉功能和精神行为等方面有不同程度改善和进步。

但不容忽视的是，细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾的临床研究尚处初级阶段，绝大多数临床研究来自单中心资料，并非双盲随机对照，样本量不大、细胞种类繁杂、细胞质控不一、疗效标准不同以致报道结果趋势离散、循证医学力度不足。儿童处于脑发育期，难治性脑疾病的异质性大和脑组织活检的可行性限制也增加了细胞治疗小儿严重脑损伤及神经残疾相关机制及疗效判定的难度。亟待规范和统一标准，开展多中心临床研究探索细胞治疗小儿严重脑损伤及神经残疾的适应证、适宜的细胞种类、细胞数量、移植途径、移植时间窗、疗程及配伍疗法等，以进一步释疑其安全性、有效性问题。

为此，全国相关领域专家论证后达成下述共识，以期对细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾的临床研究工作起到规范和指导作用。

二、移植细胞的种类

细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾根据其治疗机制不同，所选择的细胞种类和治疗方案有所不同。理想的脑细胞种子细胞应当具备获取简便、迁移能力强、体内可高度定向分化并整合至宿主神经系统，同时能促进宿主自身神经修复、安全性强、免疫原性低且无伦理学争议等特点。因此，可分化并整合到靶组织的功能性干细胞是首选细胞，如针对神经元损伤疾病采用神经干细胞甚至相应的神经元前体细胞，而对脑白质损伤等脱髓鞘疾病采用能分化并形成髓鞘结构的少突胶质前体细胞。然而目前获得功能性细胞技术仍有待突破，就当前研究现状而言，仍需主张移植细胞类型的多元化，尽可能多地实现细胞替代作用及旁分泌因子效应。目前针对小儿难治性神经系统疾病治疗的种子细胞主要有NS/PC、MSC、MNC和成髓鞘细胞等。

NS/PC：NS/PC是中枢神经系统各种神经细胞的前体细胞，在体内外可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。NS/PC移植到动物体内后可向病灶迁移并存活，主要分化为神经元和星形胶质细胞，分化的神经元具有自发动作电位，可与宿主细胞形成突触联系和神经回路，从而改善运动、学习和记忆能力，促进宿主缺失功能的部分恢复。已报道的临床研究采用NS/PC治疗新生儿HIE、儿童脑性瘫痪、智力发育障碍、中枢视觉障碍和PMD等中枢神经系统疾病，使部分患儿的神经功能得到了一定恢复［21, 23-26］。

MSC：MSC来源于骨髓、脐带、脂肪或胎盘等，不同组织来源的MSC具有相似的生物学特性。动物实验发现MSC移植能降低脑室出血新生大鼠的炎性因子，减少细胞死亡，改善HIE动物的神经功能［27］。将MSC直接移植或经预处理获得神经干细胞表型后进行移植可以有效地改善脑性瘫痪患儿的临床症状，提高其运动功能评分［17,20］。尽管MSC在体外可以分化为神经元样细胞，但植入体内后MSC分化为神经元样细胞的能力有限［28］。对于MSC修复神经损伤的机制，目前更倾向于其旁分泌作用。因此，将MSC旁分泌物质（即干细胞衍生物）分离提纯后应用于脑病治疗不失为良策。干细胞衍生物包括MSC分泌的细胞活性因子和外泌体等，提纯后的干细胞衍生物含有高浓度的符合生理配比且具有生理活性的多种因子及miRNA、mRNA等核酸成分。干细胞衍生物的最大优势是可在损伤急性期应用，及时改善微环境和促进神经修复，动物实验显示采用干细胞衍生物治疗新生鼠脑损伤疗效显著［29-31］。

MNC：MNC来源于骨髓或脐带血，易于采集、无需体外培养和安全性高等优点使得临床可操作性强。采用MNC临床治疗小儿新生儿HIE、脑性瘫痪和孤独症谱系障碍不乏有效报道［12,32-33］。

成髓鞘细胞：成髓鞘细胞主要有少突胶质前体细胞（oligodendrocyte progenitor cell， OPC）、OEC和雪旺细胞。儿童脑白质损伤是小儿严重脑损伤及神经残疾的常见病理类型，其根源在于神经元轴突的脱髓鞘病变。目前常用的NS/PC、MSC等细胞移植后有一定的促内源髓鞘再生能力，但细胞自身很难在脑内分化并形成髓鞘。OEC体内有一定的成髓鞘能力，但异体来源困难，自体鼻黏膜OEC的提取扩增值得研究，OEC并非自然条件下中枢神经系统成髓鞘细胞。自然条件下中枢神经系统成髓鞘细胞是OPC，是治疗脑白质损伤的最佳种子细胞［34］。

在以上种子细胞中，NS/PC是中枢神经系统天然的前体细胞，具有分化为各类神经细胞的能力，同时具备细胞替代效应和因子效应，理论上应当是最佳的移植种子细胞。目前研究也提示，在急性缺氧（缺血）脑损伤和皮质神经元损伤的动物实验中发现，NS/PC移植对动物行为学改善能力最强，同时移植到体内后细胞的分化存活方面也具有优势，优于MSC或MNC移植疗效［35-37］。

因此，在临床上推荐优选NS/PC或其分化的功能性前体细胞，次选MSC和MNC。同时应当注意的是，染色体病和遗传性疾病不能采用自体细胞移植。

三、移植细胞的生物学标准

任何移植细胞首先需要满足的共同标准是：无微生物污染、无致热源、细胞活率不低于95%、pH值和渗透压符合生理特征、无急性和慢性毒性、核型正常、无致瘤性和无促瘤性。不同的细胞还应当具备各自独特的生物学特点，推荐参考标准如下：

（一）NS/PC

由于ESC来源的NS/PC具有ESC残留所致的致瘤性风险，成体NS/PC细胞系是未来的趋势。临床应用时建议采用同一批次的细胞，保证其生物学特性一致以便于疗效分析［38］。NS/PC系在使用前需经完整的分析鉴定，其主要特征如下：

1.呈悬浮球状生长，球边缘有毛刺状突起；

2.增殖稳定，群体倍增时间3 ～ 4 d；

3.核型稳定、STR不发生改变；

4. nestin强阳性表达；

5.体外诱导可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

（二）MSC

需满足国际干细胞生物学学会（International Society for Stem Cell Research， ISSCR）规定的MSC特性（39）：

1. MSC可贴附塑料生长；

2. CD73、CD90和CD105强阳性表达，而CD34、CD45、CD14/CD11b、CD19/ CD79α、HLADR等标志物应为阴性表达；

3.具备成骨、成软骨和成脂分化能力。

（三）MNC

MNC含有少量CD34+的造血干细胞和CD133细胞等。获得骨髓、脐带血或动员后的外周血后，采用密度梯度离心法富集MNC后应用。

（四）成髓鞘细胞

成体NS/PC来源的OPC表达O4、A2B5、NG2和PDGFR-α等标志物。自体鼻黏膜OEC表达P75NTR和GFAP等标志物。

四、细胞移植临床应用实施条件

（一）医院等级

实施细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾的临床单位必须是三级综合医院儿科、儿科专科医院或神经外科专科医院。

（二）人员资质

1.实施治疗的专业人员须具有儿科或神经外科医师资质以及细胞移植的业务培训；

2.实施治疗的负责人须具有相关专业副主任医师及以上职称。

（三）技术论证

作为一种新的临床生物治疗措施，细胞治疗必须取得所在医院医学伦理委员会（新技术委员会）和相关管理部门的批准。

（四）实验室设施和条件

1.万级净化实验室；

2.实验设备必须达到卫生部第三类医疗技术审核办公室《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》中的要求。

五、细胞移植对象

接受细胞移植治疗的患者为0 ～ 14岁的小儿严重脑损伤及神经残疾患儿，具体选择标准如下：

（一）病种选择

推荐以下5类小儿严重脑损伤及神经残疾可采用细胞移植治疗：中-重度围产期脑损伤、中-重度急性缺氧（缺血）脑损伤、中-重度中枢神经残疾、难治性自身免疫相关性脑病及代谢性脑病。

1.中-重度围产期脑损伤包括：中-重度缺氧缺血性脑病、早产儿脑室周围白质软化、早产儿弥漫性脑白质损伤和新生儿胆红素脑病（核黄疸）等。

（1）围产期脑损伤高危因素，符合以下情况之一者，结合临床症状及辅助检查明确诊断分级：①明确的宫内窘迫病史：胎心＜ 100次/min，持续5 min以上和（或）羊水Ⅲ度污染；②明确的可导致胎儿宫内窘迫的妊娠合并症：胎盘早剥、母亲呼吸心跳停止、母亲重度妊高症和胎盘脐带异常等；③明确的产后重度窒息史：出生后1 min Apgar评分≤3分，并持续至5 min仍≤5分，或脐动脉血气分析（也可以生后30 min内动脉血气分析）pH值 ＜ 7.0，或BE≤-12 mmol/L-1，或出生后5 min仍需要继续复苏或机械通气；④早产儿低血压（平均动脉血压＜胎龄）持续24 h；⑤早产儿明确的宫内严重感染或败血症。

表1　中重度和重度HIE临床诊断

（2）临床表现：①足月儿：意识改变（过度兴奋、嗜睡和昏迷），肌张力改变（增高或减弱），原始反射异常（吸吮、拥抱反射减弱或消失），频繁抽搐或持续惊厥，脑干征（呼吸节律改变、瞳孔改变、对光反应迟钝或消失） 和颅压增高（前囟饱满、颅缝增宽和血压升高），临床诊断分度见表1；②早产儿：反应较差、意识改变、抽搐、肌力和肌张力异常、神经反射异常等，反复呼吸暂停等；因早产临床症状不典型，合并症多，不易判断，故早产儿脑损伤诊断更注重影像学和神经电生理诊断依据；③新生儿核黄疸：警告期（嗜睡、拒奶、反应差、呻吟和尖叫），痉挛期（凝视、眼球震颤、头向后仰、角弓反张、抽搐和呼吸节律改变）。

（3）影像学检查诊断依据：①足月儿HIE影像学表现：头颅CT可见脑实质呈弥漫性低密度影伴脑室变窄，基底核和丘脑损伤时呈双侧对称性高密度影，头颅MRI可见T1WI脑实质呈弥漫性高信号伴脑室变窄；基底核和丘脑损伤时呈双侧对称性高信号，矢状旁区损伤时皮质呈高信号、皮质下白质呈低信号，弥散成像（DWI）对缺血脑组织的诊断更敏感，病灶在生后第1天即可显示为高信号［40］；②早产儿脑白质损伤影响学表现：头颅超声即可诊断脑室周围白质软化症，表现为在侧脑室前角、后角三角区附近及侧脑室外侧探及区域性、局限性的回声异常增强的白质，多个部位同时存在；弥漫性脑白质损伤诊断必需根据生后3 ～ 7 d头颅MRI诊断，DWI显示深部白质点片状高信号，或双侧脑室旁广泛的弥漫性对称性高信号，伴表观扩散系数（ADC）值相应减少（＜10）［41］；③核黄疸患儿头颅MRI可见T1WI 苍白球对称性高信号［42］。

（4）电生理检查诊断依据：①脑电生理检查异常：脑电图表现为脑电活动延迟（落后于实际胎龄），异常放电，缺乏变异，背景活动异常（以低电压和爆发抑制为主）等［40］；振幅整合脑电图表现为；上边界振幅明显高于正常，下边界振幅明显降低，爆发—抑制比明显延长，每分钟爆发间隔时间明显延长；②脑干听觉诱发电位：核黄疸患儿双侧诱发电位各波消失。

2. 小儿中-重度急性缺氧（缺血）性脑损伤：包括溺水、捂被综合征、异物误吸窒息、重度一氧化碳中毒、麻醉意外和心跳呼吸骤停等。

（1）急性缺氧（缺血）病史及中-重度脑损伤临床表现：意识障碍、惊厥、颅内压增高、中枢性呼吸衰竭、瞳孔对光反射消失和锥体束征等；

（2）儿童Glasgow's评分 ＜ 5分；

（3）脑电图：广泛性异常，可表现为：全导异常放电，和（或）背景活动异常（以广泛性慢波、低电压和爆发抑制为主）等；

（4）影像学检查：头颅CT或MRI+DWI呈现广泛性脑水肿及多发性脑损伤。

3.小儿难治性中枢神经残疾：包括脑性瘫痪、智力发育障碍及孤独症谱系障碍等。

（1）年龄3个月～ 14岁的中-重症中枢神经残疾儿童；

（2）智力明显低于同龄正常水平同时伴有社会适应能力缺陷的中-重度智力发育障碍患儿（智力测试GESELL评分＜ 55分,韦氏评分＜ 55分）；

（3）符合2014年全国脑性瘫痪会议修订的小儿脑性瘫痪的诊断条件及分型标准，GMFCS（Gross Motor Function Classifi cation Scale）分级系统Ⅲ～Ⅴ级的脑性瘫痪患儿；

（4）中-重度孤独症谱系障碍患儿（ABC评分＞ 67分，CARS评分＞ 36分）；

（5）合并癫痫患儿在术前尽力控制惊厥发作；

（6）不宜康复训练或康复训练治疗效果差的患儿。

4. 小儿自身免疫相关性脑病

（1）红斑狼疮性脑病：系统性红斑狼疮患儿中枢神经系统受累建议进行自体HSCT；

（2）多发性硬化（MS）：处于病情复发—缓解期的MS患者，临床和核磁共振均显示较高的炎性活动指标，且采用多种常规方法治疗后病情仍迅速恶化者。Marburg型MS患者，在近一年内因MS导致严重残疾者也可进行自体HSCT，患者如丧失行走能力（一个扩展残疾得分规模上限为6.5分），慎重选择HSCT。

HSCT通过免疫重建诱导宿主免疫耐受，从而纠正自身免疫性脑损伤，但对陈旧性脑损伤无效；在造血、免疫功能重建，自身免疫病活动静止的情况下，选择序贯NS/PC、OPC、MSC移植，有望进一步修复脑损伤，改善脑功能。

5. 小儿遗传代谢性脑病

（1）临床选择：粘多糖贮积症（MPS） IH、Ⅵ型，X连锁脑型肾上腺脑白质营养不良（X-ALD），迟发型异染性脑白质营养不良（MLD），a-甘露糖苷病。

（2）临床推荐：MPS IH/S、戈谢病Ⅱ、Ⅲ型，尼曼匹克C型，Wolman病、幼年型MLD，早发型球状细胞性脑白质营养不良（GLD），迟发型GLD，天冬氨酰葡糖胺尿症，Farber病。以上疾病经HSCT治疗后多数酶代谢障碍得以纠正，临床症状改善，但部分患儿病情控制不佳，故酌情选择HSCT。

（3）临床研究：对于MPS Ⅱ型，幼年发作型Tay-Sachs病、幼年发作型Sandhoff病、神经元蜡样脂褐脂沉积征、神经节苷脂沉积症、Pompe病和岩藻糖苷累积病。以上疾病HSCT疗效有待进一步观察。

MPS及ALD是一组小儿遗传代谢疾病，由于特异性酶的缺乏，导致神经毒性的底物堆积和生理功能的产物缺乏，形成代谢性脑病。HSCT替代宿主血液细胞，通过细胞交叉纠正反应提高宿主血液及脑内缺乏的相关酶水平，纠正相应代谢紊乱，阻抑神经毒性所致的脑损伤。但HSCT对已有的脑损伤疗效有限，在造血、免疫功能重建和酶水平达到正常水平的前提下选择序贯NS/PC和OPC移植，有望进一步修复遗留的脑损伤，改善脑功能［43-45］。

（4）禁忌证：①循环、呼吸衰竭；②严重急性心、肺、肾、肝功等脏器功能障碍；③有脑疝先兆或已发生脑疝；④合并严重全身感染或颅内活动性感染；⑤合并脑部肿瘤及其他恶性肿瘤；⑥合并广泛颅内出血，或出凝血功能障碍伴有出血倾向者；⑦伴有中枢神经系统以外神经肌肉损害；⑧严重过敏体质；⑨人体脑内小胶质细胞来源于骨髓巨噬细胞，HSCT后来源于健康供者的巨噬细胞迁移至脑内并达到能纠正脑内代谢的细胞数量需要6个月以上，因此，代谢性脑病患儿脑损伤严重或快速进展期是相对禁忌症；⑩HSCT时患儿机体状况不能耐受者。

（二）细胞移植的围手术期处理

1.知情告知：向家长讲解干细胞移植的背景知识，告知拟采用的细胞种类、移植途径、可能的疗效、手术及移植相关风险及可能的不良事件、后续治疗和随访。

2.常规术前检查：血尿便常规、凝血功能、免疫四项、乙肝五项及生化全套。术前行头颅MRI或CT检查，脑电图检查（建议使用视频或稍长程脑电图记录2 ～ 4 h）。

3.细胞准备

（1） NS/PC应采用已经提前在GMP控制条件下建立的细胞系，并进行细胞标志物、分化能力、微生物污染、染色体稳定性、端粒酶活性、毒性实验、促瘤性及裸鼠致瘤性等安全性检测，检测无异常的细胞方可用于临床研究。

（2） 自体MNC准备：术前3 d开始予以骨髓动员，每天皮下注射集落刺激因子5 μg/kg，间隔12 h注射动员1次，手术当日上午进行骨髓穿刺，抽取骨髓1.5 ml/kg，立即送实验室进行MNC分离。

（3） 自体骨髓MSC准备：术前两周进行骨髓穿刺，抽取骨髓8 ～ 10 ml，送实验室进行MSC培养扩增。

（4） 自体外周血CD34+分选HSCT的细胞准备：CTX （3 ～ 4 g/m2）分2 d静滴，待白细胞降至最低，给予重组人粒细胞集落刺激因子5 μg/（kg·d）动员，第4天用血细胞分离机采集外周血MNC，通过CliniMACS细胞分选仪分选CD34+细胞，分选过程去除3 ～ 4个对数级CD3+T细胞。

（5） 异基因HSCT的细胞准备：HLA 6/6全相合同胞及HLA10/10相合非血缘HSC健康供者，重组人粒细胞集落刺激因子5 μg/（kg·d）动员，第4天用血细胞分离机采集外周血MNC；公共脐血库搜寻HLA5-6/6相合非血缘脐血。

六、移植途径和时间窗选择

已报道的细胞治疗脑病的移植途径包括：脑实质内移植、侧脑室内移植、小脑延髓池和脊髓腰段等蛛网膜下腔穿刺、动静脉输注。动物实验提示经动脉或静脉途径进行干（祖）细胞移植疗效相近，但由于血脑屏障的存在，脑实质、侧脑室、蛛网膜下腔移植更有利于移植细胞归巢，发挥细胞替代效应［46-47］。因此，细胞移植途径与移植细胞效应有关，如果采用NS/PC移植，为尽可能发挥其分化替代作用，推荐选择脑实质或侧脑室、小脑延髓池等接近中枢神经系统的移植途径；若采用MSC和MNC移植，主要利用其旁分泌因子效应，可以考虑腰椎穿刺或操作更简便的静脉、动脉等经血液系统移植途径。另外细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾因其不同的病理阶段和脑损伤的不同病理机制，细胞移植途径和时间窗也有所不同。

1.小儿急性脑损伤

对于急性脑损伤，原则上是越早进行细胞移植治疗越好，但损伤后非特异炎症反应、自由基、兴奋性氨基酸等导致的细胞毒性环境不利于移植细胞存活，然而，此时血脑屏障短暂开放，脑内炎性环境会产生大量趋化因子利于移植细胞向病灶迁移。因此，急性脑损伤早期宜于采取侧脑室、蛛网膜下腔或动、静脉移植途径，回避脑内炎性环境对移植细胞的直接损伤作用，提高移植细胞向脑内病灶迁移的效率，同时发挥移植细胞旁分泌因子效应［12,36,48］。

在脑损伤急性期后期，尤其急性脑损伤72 h ～ 7 d之后，随着脑内细胞毒性环境逐渐减弱，病灶表达的大量有丝分裂原、营养因子及胞间基质分子有利于促进内源及外源移植神经细胞增殖分化［49］，此时可首选脑实质原位移植，侧脑室及蛛网膜下腔穿刺也不失为理想的移植途径。动物实验研究结果表明在损伤早期，静脉移植MSC或MNC均可改善动物神经功能，7 d后静脉移植的疗效明显减弱，但脑实质或蛛网膜下腔途径移植疗效显著［48,50］。

2. 小儿脑损伤后遗症及其他中枢神经残疾

对于脑损伤后遗症期和非进行性中枢神经残疾，细胞移植的时间窗没有严格限制，但脑性瘫痪患儿主张在肌肉萎缩、骨骼关节畸形之前接受细胞移植治疗。小儿处于生长发育阶段，初生患儿脑重量仅350 ～ 400 g，6 ～ 10岁左右达到1200 g，20岁左右脑发育成熟，智力运动功能亦随之经历了不同发育里程碑阶段。与成年人相比，小儿脑内环境更加有利于细胞移植治疗的细胞替代和因子效应的发挥。因此，对于常规方法疗效不佳的脑损伤后遗症及其他中枢神经残疾患儿建议尽早尝试细胞移植治疗，可能提高有效几率和疗效。需要说明的是，小儿脑发育阶段，智力和运动的任何改善都可能引发里程碑式的放大效应。脑损伤后遗症期和非进行性脑损伤及神经残疾的细胞移植治疗机制尚不明确，细胞替代效应和细胞旁分泌的因子效应孰轻孰重有待研究，细胞移植途径的选择尚需要对比研究。有研究表明脑室移植途径能刺激室管膜下区内源性干细胞增殖和迁移，同时移植的外源性细胞能跨越血脑屏障向脑实质迁移，建议脑损伤部位广泛或无明确病灶患儿首选侧脑室或蛛网膜下腔移植途径，病变局限患儿推荐首选脑实质移植。

3.小儿自身免疫性脑病和遗传代谢性脑病

对于难治性自身免疫性脑病、遗传代谢性脑病等进行性脑损伤首先进行HSCT，以纠正自身免疫性脑损伤和纠正代谢紊乱神经毒性所致的脑损伤。HSCT对于已有的骨骼畸形和心脏瓣膜损伤无效，对已有的脑损伤疗效有限，因此溶酶体贮积症及肾上腺脑白质营养不良一旦确诊应尽早HSCT。在造血、免疫功能重建和酶水平恢复正常的前提下选择序贯NS/PC、OPC移植，力图修复难治性自身免疫相关性脑病，遗传代谢性脑病遗留的脑损伤。

七、移植方案

（一）急性脑损伤

推荐进行3次细胞移植。建议72 h内首选移植途径依次为侧脑室、蛛网膜下腔穿刺和动（静）脉输注；脑损伤后7 ～ 10 d，严重脑水肿消退时进行第2次移植，移植途径推荐脑实质移植；间隔3 ～ 7 d后进行第3次移植，移植途径依次选择蛛网膜下腔、动（静）脉输注移植。海军总医院儿科在急性脑损伤早期采用干细胞旁分泌的细胞因子提取物可改善急性期脑内微环境，阻抑宿主及移植细胞凋亡，使首次细胞移植治疗时间窗提前至脑损伤后72 h以内。

（二）脑损伤后遗症及其他中枢神经残疾

对脑性瘫痪、智力发育障碍及孤独症谱系障碍患儿，推荐进行3次移植，第一周进行脑实质移植或侧脑室/小脑延髓池移植，间隔5 ～ 7 d进行第2次及第3次移植，后两次移植途径可依次选择蛛网膜下腔、动/静脉途径。可在3次移植治疗的同时予以干细胞衍生物进一步提高疗效。重症患儿可在6 ～ 12个月后再次细胞移植有助于提高疗效。

（三）自身免疫性脑病及代谢性脑病

对自身免疫性脑病及代谢性脑病等进行性脑损伤首先进行HSCT纠正自身免疫性脑损伤和纠正代谢紊乱神经毒性所致的脑损伤。自身免疫性脑病首选CD34+分选自体造血干细胞移植，次选HLA全相合异基因脐血，采用非清髓预处理方案；遗传代谢性脑病HSCT依次选择全相合健康同胞外周血、无关脐血和无关骨髓（外周血）移植，采用清髓预处理方案。在造血及免疫功能重建，自身免疫活动静止、酶水平恢复正常的前提下选择NS/PC、OPC和MSC序贯移植，方案同上。

（四）移植细胞数量：不同途径下移植细胞数量

推荐如下［17-18, 20-22, 25-26, 38, 51-54］

1.脑实质途径：推荐NS/PC、OPC、MSC，细胞数106，容积不超过200 μl；

2.侧脑室途径：推荐NS/PC、OPC、MSC，细胞数（6 ～ 10）× 106，容积不超过500 μl；

3.腰椎穿刺途径：推荐NS/PC或MSC，细胞数（6 ～ 10）× 106，容积不超过2 ml；

4.动脉途径：推荐MSC或MNC，MSC 6 × 106/ kg，MNC不低于1.0 × 108，容积10 ～ 20 ml；

5.静脉途径：推荐MSC或MNC，MSC 6 × 106/ kg，MNC不低于1.0 × 108，容积10 ～ 20 ml；

6.干细胞衍生物以2.0 × 107细胞获得的产物为一个新生儿使用剂量，儿童1次可使用2 ～ 3个新生儿剂量，可血管或腰椎/脑室穿刺途径；

7.自体CD34+细胞分选HSCT：CD34+细胞数≥2×106/kg；CD3+T细胞数≥104/kg（较前降低3个对数级）；

8.异基因HSCT：HLA全相合骨髓/外周血有核细胞（total nucleated cell， TNC） 5 ～ 10 × 108/kg，CD34+细胞数（2 ～ 6）×106/kg；脐血CD34+细胞数≥2×105/kg，TNC≥4 × 107TNC/kg（5/6 HLA相合）或TNC ＞ 3.7 × 107/kg（6/6 HLA相合）。

采用经血移植途径时，需保证细胞为单细胞悬液防止栓塞。

（五）抗免疫排斥药物

细胞移植治疗期望值以细胞替代效应为主的前提下，可以考虑短期（1个月）使用小剂量抗免疫排斥药物，减少宿主免疫排斥。口服环孢菌素A（新生儿及婴儿禁用），维持血药谷浓度70 ～ 100 ng/ml。

八、细胞移植安全性评价

（一）细胞安全

干细胞制备、鉴定及临床前研究应当符合卫生部2013年《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》的相关要求。细胞体外培养推荐采用无动物源性成分的培养基，但由于细胞毕竟经历了长期的体外操作，要密切注意细胞培养过程中的意外事件，确保移植细胞满足上述细胞标准。

（二）移植不良事件监测与评估

除了一般生命体征监测外，需要监测脑脊液漏、情绪、行为、精神、睡眠、惊厥、栓塞、颅内出血、中枢神经系统感染和肿瘤等中枢神经系统事件的发生。

1.中枢神经系统感染：发热＞ 12 h，伴有精神、食纳差、呕吐和惊厥，需要进行血常规、CRP和降钙素原检查，必要时行腰椎穿刺脑脊液检查。发热＞ 24 h，临床伴有意识和精神改变及新的中枢神经系统症状，即使血常规、CRP和降钙素原检查阴性，也需要进行腰椎穿刺脑脊液检查。

2.颅内出血：当出现生命体征不稳定及意识障碍、瞳孔变化、惊厥等，需考虑硬膜下、蛛网膜下腔、脑实质及脑室内出血，紧急行头颅CT检查，出血严重时进行外科手术治疗。若发热＞ 2 d，伴精神、食纳差、呕吐，或出现惊厥发作，要警惕颅内少量出血的发生，根据出血部位及出血量给予观察或腰椎穿刺冲洗等对症治疗，必要时外科手术治疗。

3.栓塞：接受动、静脉移植的患儿出现各脏器栓塞的相关症状和体征时，需进行相关血液、B超、CT或MRI检查，进行紧急处理。

4.惊厥发作：患儿出现可疑惊厥发作或原有发作加重时，需进行脑电图检查，排除颅内出血及感染的同时，调整或加用抗癫痫药物。

5.肿瘤：国内外有关成体NS/PC、MSC体内外致瘤性研究结果趋向无致瘤性，海军总医院儿科对接受神经前体细胞移植1 ～ 8年的患儿进行随访也未见肿瘤发生，成体干/祖细胞移植临床应用致瘤性很低已经毋庸置疑，但无致瘤性的临床结论还为时过早，需要大样本多中心远期随访观察。患儿移植后随访至少2年，出现新发神经系统症状体征时需进行头颅CT或MRI检查除外肿瘤的发生。

九、术后随访与疗效判断

细胞移植后近期疗效可在术后数天发生，远期疗效出现在术后3 ～ 6个月甚至1年，疗效持续无倒退。以智力、语言、精神、行为、生活能力以及运动、肌张力、姿势、异常反射的改善与进步为有效。疗效观察分近期1 ～ 3个月、中期3 ～ 12个月、远期12 ～ 24个月，具体疗效判断及不良事件随访见表2。

十、细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾临床研究有待解决的问题

（一）多中心系统研究

开展随机、双盲（开放）式对照（脑性瘫痪等异质性大的神经残疾可以采用自身交叉对比）、前瞻性多中心和大样本的临床试验研究，统一病例入选标准，统一细胞质控标准，统一临床试验方案及疗效判断标准，评价细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾的安全性和近远期疗效，明确小儿严重脑损伤及神经残疾的适应症，适宜于不同疾病种类和病理阶段的细胞种类、细胞数量、移植途径、移植时间窗、疗程及配伍疗法等。

（二）探究不同干/祖细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾的细胞替代效应和细胞旁分泌因子效应

动物实验发现神经细胞移植后在脑内可以长期存活并在体内增殖分化［55］，人体试验后活检也显示移植的细胞至少能存活23个月［56］，但仍需更多的实验证据支持移植后细胞长期存活并寻找促进长期存活并发挥细胞功能的手段。争取伦理学突破，采用细胞示踪乃至活检技术，寻求不同干（祖）细胞移植后脑内迁移、增殖和分化的细胞替代效应的直接证据；结合临床影像检查、脑电生理检测及脑功能评估分析，采用现代分子生物及分析技术探索不同细胞的旁分泌因子效应均十分必要。以上研究对于治疗小儿严重脑损伤及神经残疾的细胞选择和技术进步，对于探索细胞移植治疗机制和调控手段具有重大指导意义。

（三）细胞移植的脑内微环境调控

MSC和NS/PC等HLA抗原低表达创造了诱导免疫耐受，减少免疫排斥和提高移植细胞存活的可能性。脑内微环境直接影响干/祖细胞移植的疗效，如急性脑损伤的炎性环境不利于植入细胞存活、但胚胎内环境的再现又利于植入细胞的迁移与分化；脑损伤后遗症期内环境有利于植入细胞存活但又不利于植入细胞的增殖、迁移与分化。抗炎与趋化、脱髓鞘与髓鞘化、胶质瘢痕与细胞迁移、神经坏死与神经再生、细胞增殖与分化、供者、宿主细胞整合与免疫耐受等内环境的调控仍然是细胞移植治疗中有待研究和突破的瓶颈。

表2　急性脑损伤和儿童神经损伤残疾病的疗效判断及不良事件随访表

（四）干细胞移植治疗安全性尤其是远期安全性

纵览国内外成体干细胞移植治疗神经系统疾病的动物实验及临床研究，总体结论是安全的，但其安全性仍是需要重点关注的问题。对MSC致瘤性的报道不一，有实验发现MSC可促进肿瘤细胞生长和转移［57］，也有研究发现MSC可抑制肿瘤细胞生长［58-59］，但MSC移植后形成肿瘤未见报道。对于神经前体细胞，以色列科学家2009年报道一名共济失调毛细血管扩张症（ataxia telangiectasia，AT）患者经腰椎蛛网膜下腔接受神经前体细胞移植，供者来源于胎脑组织，但未接受致瘤相关的安全性检测，4年后在受者细胞移植部位发现供者来源的良性胶质瘤［60］。值得提醒的是，AT患者合并免疫力缺陷，其肿瘤发病率是正常人的40 ～ 100倍［61］。尽管如此，这唯一的临床致瘤性报道警示我们需要对移植细胞系进行严格的细胞染色体、促瘤性、致瘤性等体内、外鉴定的的基础上，开展近、远期大样本和多中心细胞移植致瘤性临床随访研究，尤其是形态学随访，进一步确认成体干细胞移植的安全性。

（五）加强细胞技术研究是提高细胞替代和细胞因子效应的方向

iPS是将终末分化细胞通过一定的重编程手段，使其逆转成为具有和ESC相似的分化全能性的干细胞。iPS来源于自体，无免疫排斥及伦理学争议，但在iPS致瘤性及高效定向分化等问题尚未解决之前，成体神经干细胞源的各种功能神经元以及兼有迁移及髓鞘化功能的OPC等靶向神经细胞诱导分化技术仍然是提高细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾细胞替代效应的研究方向。基因转染表达IGF-1或BDNF等神经营养因子、低氧预处理等措施可能是提高细胞旁分泌因子效应的措施。

（六）多胚层、多功能细胞联合应用是未来治疗研究的方向

多胚层来源、多功能细胞联合及序贯治疗小儿自身免疫性及遗传代谢性脑病是未来研究方向之一。造血干细胞移植清除宿主免疫、重建供者免疫，为诱导第二供者NS/PC、OPC和MSC等神经修复细胞的免疫耐受创造了可能性。

细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾基础与临床研究结果令人鼓舞，但仍处于基础研究向临床应用转化的初级阶段，作为综合治疗的一种新的治疗手段，其本身并不排斥和否定已有的治疗手段，对其期望值也应从客观及动态的视角出发。细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾的初期目标是部分有效和疗效有限。基础与临床研究循环往复，循证医学基础上的螺旋式发展，才能更上一层楼。

志谢（按姓氏拼音排序）：

陈光福 深圳市第二人民医院

方凤 第二军医大学附属长海医院

贾飞勇 吉林大学第一医院

李华强 第三军医大学大坪医院

李秋平 北京军区总医院附属八一儿童医院

梁松 湖北省中山医院

刘汉楚 武汉市儿童医院

栾佐 中国人民解放军海军总医院

罗蓉 四川大学华西第二医院

麦坚凝 广州市儿童医院

农绍汉 广东省人民医院

孙若鹏 山东大学齐鲁儿童医院

唐久来 安徽医科大学第一附属医院

王来栓 复旦大学附属儿科医院

许东升 同济大学

余健 广州军区武汉总医院

余章斌 南京医科大学附属南京妇幼保健院

袁天明 浙江大学医学院附属儿童医院

赵丽 中国人民解放军白求恩国际和平医院

张传森 第二军医大学

郑成中 中国人民解放军第306医院

邹丽萍 中国人民解放军总医院

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2015-09-10）

（本文编辑：陈媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.001

100048北京，中国人民解放军海军总医院儿科

栾佐，Email：luanzuo@aliyun.com