黄杯杜鹃总黄酮提取工艺研究

邓斌格　成佳威

（湖南科技学院 生命科学与化学工程系，湖南 永州 425199）

黄杯杜鹃总黄酮提取工艺研究

邓斌格成佳威

（湖南科技学院 生命科学与化学工程系，湖南 永州 425199）

研究黄杯杜鹃总黄酮的最佳提取工艺。采用回流提取黄杯杜鹃总黄酮，紫外分光光度计测定总黄酮提取率。通过单因素试验研究乙醇体积分数、液料比、提取次数、提取时间对总黄酮提取含量的影响，通过正交试验进一步优选最佳提取工艺。单因素试验结果显示，乙醇体积分数50%、提取次数3次、提取时间3h、液料比1:20(g/ml)条件下黄杯杜鹃总黄酮提取率高；正交试验结果表明：黄杯杜鹃总黄酮的最佳提取工艺为提取时间2 h、乙醇体积分数60%、提取1次、料液比1 :25的条件下黄杯杜鹃总黄酮提取率较高；本工艺简单可行，有较好的参考价值。

黄杯杜鹃；总黄酮；提取工艺；正交试验

杜鹃花属(Rhododendron Linn.)是杜鹃花科(Ericaceae) 中最大的一个属，全世界约有960种，广布于欧、亚、北美的温带地区[1]。我国是杜鹃花属植物种类最丰富的国家，是世界杜鹃花属植物的主要分布中心[2]。该属植物具有较高的药用价值，如祛痰止咳[3-7]、抗菌消炎[8]、镇痛[9-10]、对心血管系统的保护[11-13]等具有显著作用，因此有广阔的开发应用前景。本课题组在前期研究发现，黄杯杜鹃富含黄酮类成分，其枝叶粗提物中总黄酮含量高达4.9%。本研究和实验的目的是通过对黄杯杜鹃总黄酮提取，优化其最优提取工艺，得到黄酮纯度高的粗提物，为合理开发利用黄杯杜鹃植物资源提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

黄杯杜鹃叶（R.wardii）: 采自四川雅安，经湖南科技学院姜红宇博士鉴定。

芦丁标准品（上海生化试剂公司）、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、二氯甲烷、盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝，以上试剂均为分析纯，全部购于天津市福晨化学试剂厂。

UV 2800紫外可见光分光光度计舜宇恒平有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂；SHZ-III循环水多用真空泵郑州市长盛实验仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备

称取芦丁对照品10.0 mg，用80 %的甲醇定容至50 ml量瓶中，摇匀得质量浓度为0.2mg∙ml-1的对照品溶液。

1.2.2总黄酮定量测定 参考文献[14]分光光度计法

1.2.3标准曲线的绘制

吸取上述芦丁标准液0.0、4. 0、5. 0、6. 0、8. 0、10. 0和12. 0 ml于25ml容量瓶中，各加入1. 25ml 5%亚硝酸钠，摇匀。放置5min后再各加入10%硝酸铝1. 25ml，摇匀。5min后再加入4%的氢氧化钠溶液10ml，混匀并用80%甲醇稀释至刻度。15min后于510nm处测吸光度（A），试剂为空白参比，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=10.274x+0.0461（R2=0.9939）。

图1　芦丁对照品标准曲线

1.2.4总黄酮提取的正交试验

根据单因素试验结果，确定以乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、提取次数(C)、液料比(D)为试验因素进行正交设计，每因素3 个水平(表1)，按照L9(34)正交表进行试验(表2) ，优化黄杯杜鹃总黄酮的提取工艺。

表1　黄杯杜鹃总黄酮提取工艺正交试验因素水平

1.2.5最佳提取工艺验证实验

为进一步验证优选工艺的可靠性及稳定性，精密称取黄杯杜鹃粉末1.00g（平行3份），在1.2.4节所得最佳提取工艺条件下提取黄杯杜鹃总黄酮，计算总黄酮提取率。

2　结果与分析

2.1影响总黄酮提取含量的单因素试验

2.1.1料液比对总黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70%、提取时间2h、提取2次的条件下，研究料液比对黄杯杜鹃中总黄酮提取含量的影响。结果表明：随溶剂量的增加，总黄酮提取含量明显升高，当料液比大于1:20(g/ml)时，提取含量升高速度减慢；小于1:20(g/ml)时，提取含量随液料比的增加而增加。随着溶剂量增加，质量浓度梯度增大，总黄酮溶出速率和含量变大。当总黄酮充分溶出后，即使继续加大溶剂量，总黄酮的提取率基本趋于稳定，甚至下降。在实际操作中考虑总黄酮的充分溶出同时也避免溶剂的浪费，故正交试验设计中料液比设置为1:10～1:30(g/ml)。

图2　液料比对总黄酮提取含量的影响

2.1.2乙醇体积分数对黄杯杜鹃总黄酮提取率的影响

在料液比1:20、提取时间2h、提取2次的条件下，研究乙醇体积分数对黄杯杜鹃中总黄酮提取含量的影响。结果表明：当乙醇体积分数较小时，总黄酮提取含量随着乙醇体积分数的增大而升高，当乙醇体积分数50% 时达到最高值；当乙醇体积分数大于50% 时，总黄酮提取含量反而有所降低。造成这种现象可能是由于乙醇体积分数过大时，水溶性黄酮的溶出减少而脂溶性杂质如色素、鞣质等溶出增多，由于杂质与脂溶性黄酮竞争溶剂，从而使黄酮提取量下降。故在正交试验设计中

乙醇体积分数设置为30%～70%。

图3　乙醇体积分数对总黄酮提取含量的影响

2.1.3提取时间对总黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70%、料液比1:20、提取2次的条件下，研究提取时间对黄杯杜鹃中总黄酮提取含量的影响。结果表明：黄杯杜鹃总黄酮提取含量随提取时间的延长而升高，当提取时间大于2h 后总黄酮提取含量趋于稳定。在选择提取时间时既要考虑有效物质是否充分溶出，也要注意过长时间的高温提取对化合物结构的影响，故正交试验设计中设置提取时间为1.0～3.0h。

图4　提取时间对总黄酮提取含量的影响

2.1.4提取次数对总黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70%、料液比1:20、提取2h的条件下，研究提取次数对黄杯杜鹃中总黄酮提取含量的影响。结果表明：黄杯杜鹃总黄酮提取含量随提取次数的加大而升高，当提取次数大于3次后总黄酮提取含量趋于稳定。在选择提取次数时既要考虑有效物质是否充分溶出，也要注意多次的高温提取对化合物结构的影响，故正交试验设计中设置提取时间为1～4次。

图5　提取次数对总黄酮提取含量的影响

2.2正交试验优选黄杯杜鹃总黄酮提取工艺

表2　总黄酮提取工艺正交试验设计及结果

根据单因素试验结果，选择温度、乙醇体积分数、提取次数、液料比等较优水平，按L9( 34) 设计正交试验。结果表明：乙醇体积分数对黄杯杜鹃总黄酮提取率影响最大，提取次数对黄杯杜鹃总黄酮提取率影响较大，其次，液料比对总黄酮的提取有一定影响，4个因素中，以提取时间影响最小；由正交试验结果得出最优因素水平组合为A3B3C1D3，即乙醇体积分数60%、提取时间2 h、提取次数1次、料液比1 :25。

2.3验证试验

为进一步验证优选工艺的可靠性及稳定性，取5份黄杯杜鹃粗粉，没份1.00g，按上述最优工艺条件进行验证实验，测得平均总黄酮提取率为9.18%，相对标准偏差（RSD）为0.75%。所得总黄酮回收率高，适宜于生产应用。

3　结　论

本实验以乙醇为溶剂，以黄杯杜鹃总黄酮提取率为考察指标，通过对提取次数、乙醇体积分数、提取时间、液料比进行单因素试验和正交试验，优选出黄杯杜鹃总黄酮的最佳提取工艺为A3B3C1D3，即乙醇体积分数60%、提取时间2 h、提取次数1次、料液比1 :25。该工艺操作简便、成本低、收率高，具有良好的稳定性和重复性，可为黄杯杜鹃总黄酮的工业化生产提供科学依据。

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(责任编校：何俊华)

R284.2

A

1673-2219（2015）05-0069-04

2015－01－11

邓斌格（1994－），男，成佳威，湖南科技学院学生。