金银花叶总黄酮抑菌作用研究

原增艳等

【摘 要】目的：探讨金银花叶总黄酮的体外抑菌作用。方法：采用管碟法及微量稀释法，测定不同浓度的总黄酮对不同病原微生物的抑菌效果及最小抑菌浓度。结果：金银花叶总黄酮提取物对6种菌株均有抑制作用，金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌对金银花叶总黄酮最敏感，抑菌圈直径>15mm，MIC≥1；金黄色葡萄球菌的标准菌株和耐甲氧西林耐药菌株对金银花叶总黄酮的敏感度无明显差异。结论：金银花叶总黄酮有一定的抑菌作用。

【关键词】金银花叶；总黄酮；抑菌作用；最小抑菌浓度

金银花（Flos Lonicerae）为忍冬科植物，其干燥花蕾或初开的花，具有清热解毒、抑菌、抗氧化等功效，是常用中药材之一[1]。但是金银花的叶片作为副产品，产量很高，一直作为废弃物被丢弃，没有得到充分的利用。古代医家以人体自身进行多次临床实践，得出了“花叶同效”，明朝李时珍说“忍冬茎叶及花功用皆同”[2]，具有药效。在金银花叶中的总黄酮含量是花中的2.78倍[3]，黄酮类化合物有非常广泛的抗菌作用[4-6]。金银花叶中总黄酮抗菌作用如何对金银花叶的开发利用至关重要，因此，本文对金银花叶中总黄酮进行粗提，初步探讨金银花叶片中的总黄酮的体外抑菌作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

金银花叶：河南封丘，新乡博凯生物技术有限公司加工，系5月份第一茬花，将其上叶片取下，晾干，粉碎，过40目筛，备用。

菌株：大肠埃希菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、肺炎链球菌（ATCC49619）、临床分离MRSA菌株253、254。以上菌种均由新乡医学院三全学院临床微生物学与免疫学检教研室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮的提取

称取金银花叶粉末30g，按固液比1：10加入75%乙醇，于70℃提取1.5h，抽滤，滤渣再加入300mL75%乙醇，提取1h抽滤，合并两次提取液，减压蒸除溶剂；浓缩后提取液加适量水溶解，石油醚脱色，取下层液体；再用乙酸乙酯萃取，每次100mL，萃取至溶剂层无色；合并上层液体，减压浓缩，浓缩后的提取物即为金银花叶的总黄酮。

1.2.2 菌悬液的制备

将供试菌株在血平板上活化，以无菌生理盐水配制菌液，用MHA肉汤调整菌液浓度至1×105cfu/mL。

1.2.3 抑菌效果的测定

采用管碟法，在无菌条件下，吸取已配制好的菌悬液100μL放入MH培养基上，用无菌棉签涂抹涂匀，稍干后在每个平皿内等间距的放入3个无菌钢管，静止5min。以无菌生理盐水为空白对照，每孔加微孔过滤器灭菌的10mg/mL总黄酮100μL，将平皿盖好，37℃恒温箱内培养18-24h后，用游标卡尺测量清晰抑菌圈直径（mm），每种提取物平行6次。肺炎链球菌需CO2培养箱培养。抑菌效果判断标准参照文献[7]：以抑菌圈直径>20mm为极敏，抑菌圈直径在15-20mm之间为高敏，抑菌圈直径在10-14mm之间为中敏，抑菌圈直径<10mm为低敏，无抑菌圈为耐药。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用微量稀释法，将总黄酮用MH肉汤倍比稀释成32、16、8、4、2、1、0.5mg/mL6个梯度浓度，各取100μL依次加入96孔板，每个浓度3个重复。每孔加入浓度为1×105cfu/mL的菌悬液，使各孔药终浓度从依次为16、8、4、2、1、0.5、0.25mg/mL。以不加菌悬液的总黄酮为阴性对照，37℃培养24h后观察结果。所有阴性对照孔培养基澄清，说明本实验方法可行。孔底部清晰不出现菌体沉淀的最低抗菌药物浓度，即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。

2 实验结果

2.1 金银花叶总黄酮提取物对不同菌株的抑菌效果比较

结果见表1，由试验结果可见，当总黄酮浓度在10mg/mL时，金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923及MRSA254、肺炎链球菌抑菌圈直径大于20mm，抑菌效果极度敏感；MRSA253、铜绿假单胞菌抑菌圈直径在10-20mm，对总黄酮高度敏感；大肠埃希菌的抑菌圈直径在10-15mm，抑菌效果为中度敏感。金黄色葡萄球菌标准菌株与耐药菌株对总黄酮的敏感度无显著差异。

2.2 金银花叶总黄酮提取物对不同菌株的最低抑菌浓度比较

结果见表2，金银花叶的总黄酮提取物对6种的菌株有不同程度的抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的抑菌效果要强于大肠埃希菌及铜绿假单胞菌的抑菌活性；总黄酮对ATCC25923、MRSA254、ATCC49619的抑菌活性最强，MIC达到0.5mg/mL，对ATCC25922的抑菌活性最弱。

3 讨论

随着抗生素的滥用，耐药菌株不断增加，出现逐年上升的趋势，中药抑菌成分较多，可作用于细菌的不同部位和繁殖的不同阶段，使病原微生物不易产生耐药性，因此，中医药预防和治疗感染性疾病近年来受到越来越多的关注，从天然植物中提取抗菌成分开发新型抗菌药的重要组成部分。研究表明，黄酮具有较好的抑菌效果，很多学者已经从丁香、乌饭树、白花蛇舌草等植物中提取黄酮，证明其较好的抑菌活性[4-6]。金银花叶中黄酮含量比常用药材金银花中的黄酮含量要高，笔者对金银花叶中总黄酮进行粗提，针对4种常见病原菌做了药敏试验及MIC的测定，由结果可见，金银花叶总黄酮对实验菌株都有抑制作用，其中对肺炎链球菌及金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好。针对目前常见耐药菌株，本文选用临床筛选的两株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌做抑菌试验，结果表明，金银花叶总黄酮对金黄色葡萄球菌耐药菌株的抑制作用与标准菌株相比无显著差异，金银花叶总黄酮的抑菌作用可能不受耐药菌株变异位点的影响，还有待于进一步研究。

【参考文献】

[1]林段嫦，宋劲诗.金银花中绿原酸提取工艺探讨[J].中成药，1994，16（7）：16-17.

[2]林国通.中药学[M].长沙：湖南科学技术出版社，1985，64.

[3]张宁，曹光群.金银花叶的抑菌活性和抗氧化性研究[J].牙膏工业，2009，3：29-33.

[4]王宇习.丁香叶总黄酮的提取液工艺及抑菌效果评价[D].黑龙江：东北农业大学，2013.

[5]张海燕，王立，张晖.乌饭树树叶水溶性黄酮的抑菌作用的研究[J].中国食品添加剂，2010（5）：62-67.

[6]王宇翔，张艳，方明，等.白花蛇舌草总黄酮的抗炎和抗菌作用[J].中国药理学通报，2005，21（3）：348-350.

[7]蒋放军.湘蕾金银花提取物体外抑菌及抗氧化作用研究[D].湖南：湖南农业大学，2006.

[责任编辑：汤静]