益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面TGF-β/ALK 5/Smad2/3通路的影响

张臻，阙华发

上海中医药大学附属龙华医院中医外科研究所，上海 200032

益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面TGF-β/ALK 5/Smad2/3通路的影响

张臻，阙华发

上海中医药大学附属龙华医院中医外科研究所，上海 200032

目的：探讨益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面转化生长因子-β（TGF-β）/激活素受体样激酶（ALK）5/ Smad蛋白2/3通路的影响。方法：将50只大鼠随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、糖尿病对照组、正常对照组。通过腹腔注射链脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型，运用Westernblot技术手段分别检测各组肉芽增生期创面成纤维细胞ALK5/Smad2/3的表达水平。结果：糖尿病对照组ALK5表达水平明显高于正常对照组（P＜0.05）；益气化瘀组ALK5表达水平明显低于糖尿病对照组（P＜0.05），其与益气组、化瘀组、正常对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。糖尿病对照组smad2表达水平明显高于正常对照组（P＜0.05）；益气化瘀组smad2表达水平与各组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。糖尿病对照组smad3表达水平明显高于正常对照组（P＜0.05）；益气化瘀组smad3表达水平低于化瘀组（P＜0.05），明显低于糖尿病对照组、益气组（P＜0.01），高于正常对照组（P＜0.05）。结论：糖尿病创面难以愈合及瘢痕形成的机制可能与ALK5/Smad2/3通路有关，益气化瘀中药可能通过抑制ALK5/Smad2/3通路，加速创面愈合，减少瘢痕形成。

糖尿病；溃疡；益气化瘀法；转化生长因子-β（TGF-β）/激活素受体样激酶（ALK）5/Smad蛋白2/3通路

笔者在应用益气化瘀中药治疗糖尿病溃疡取得显著临床疗效的基础上［1］，通过实验研究已初步证实，创面转化生长因子-β（TGF-β）1的低表达可能是糖尿病溃疡难以愈合的原因之一，益气化瘀法可以通过上调TGF-β1的表达水平，同时促进转化生长因子-β受体Ⅰ（TGF-βRⅠ）的表达，并下调sm ad3、sm ad4的表达水平，从而提高创面愈合的速度和质量［2～5］。为进一步深入探讨益气化瘀法促进糖尿病溃疡创面愈合的机制，本文研究了其对糖尿病大鼠肉芽增生期创面成纤维细胞TGF-β/激活素受体样激酶（activin receptor-like kinase，ALK）/Sm ad通路的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 益气化瘀方由生黄芪、太子参、桃仁、地龙组成，剂量比例2.5∶2.5∶1∶1，人鼠等效剂量为11.61 g/kg，减压浓缩至浓度为含生药2.5 g/m L。拆方益气方由生黄芪、太子参等组成，人鼠等效剂量为6.75 g/kg，减压浓缩至浓度为含生药1.5 g/m L。拆方化瘀方由桃仁，地龙等组成，人鼠等效剂量为4.86 g/kg，减压浓缩至浓度为含生药1 g/m L［3］。均由上海中医药大学附属龙华医院制剂室按水煎醇沉工艺制备成煎剂浓缩，4℃冰箱保存备用。ALK5一抗，Abcam公司产品（Ab155258）；Sm ad2一抗，Abcam公司产品（Ab33875）；Sm ad3一抗，Abcam公司产品（Ab40854）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔二抗，北京中山生物工程公司产品（ZB-2301）。

1.2 仪器 RM 2145切片机，Leica公司产品；IMS细胞图像分析仪，上海申腾信息技术有限公司产品；MV-CP410摄像机，Panasonic公司产品；BH2显微镜，O lym pus公司产品。

1.3 动物分组及处理 3月龄雄性SPF级W istar大鼠，体重200～250 g，平均体重（224.13±13.77）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供［许可证号码：SCXK（沪）2012-0002］。将50只大鼠随机取10只为正常对照组，其余40只大鼠复制糖尿病性模型，随机取10只为糖尿病对照组，其余30只随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组。糖尿病性模型鼠实验前12 h禁食，定量饮水。实验当日称体重，尾静脉采血和收集尿液，用血糖仪和试纸法分别测定基础血糖和尿糖，然后以pH4.6、0.1mm ol/L的枸橼酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素（STZ），配成1%溶液，以60 m g/kg体重单次腹腔内注射STZ溶液，48 h后动物血糖浓度＞16.65 mmol/L及尿糖为++++时，即成糖尿病鼠模型［6］。将所有大鼠麻醉后背部备皮，作直径10 mm的圆形标记，在无菌条件下，用外科方法切除标记处全层皮肤，止血后用无菌纱布覆盖，糖尿病性模型鼠即成糖尿病溃疡模型。造模后每只大鼠连续4天后腿肌肉注射青霉素40万单位。各组于创面造模后次日开始给药，换药前均以1/5000呋喃西林溶液清洁创面，外敷单层生理盐水纱布；正常对照组、糖尿病对照组生理盐水灌胃，每天1次；各用药组，药物灌胃，每天1次。10天后将大鼠麻醉处死，用眼科手术剪剪取全层肉芽组织，观察各组组织病理学，并以植快培养法进行成纤维细胞培养，Westernblot法检测 ALK5、sm ad2、sm ad3各指标水平变化。

1.4 Westernblot法检测 每组随机抽取8个标本作为实验样本，各样品取25μg上样，m arker取10μL上样（上样前按说明书进行预处理），将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，进行电泳。然后转移至PVDF上，用5%脱脂奶粉封闭，分别与特异性的抗体进行孵育（稀释浓度分别为ALK5，1∶500；sm ad2，1∶1000；sm ad3，1∶5000；GAPDH，1∶1500），充分洗涤后孵育HRP标记山羊抗兔二抗，ECL化学发光，显影，扫描分析，测定蛋白表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件，采用方差分析比较各组间ALK5、sm ad2、smad3表达水平的差异。

2 实验结果

各组ALK5、Sm ad2、Sm ad3比较，见表1。糖尿病对照组ALK5表达水平明显高于正常对照组（P＜0.05）；益气化瘀组ALK5表达水平明显低于糖尿病对照组（P＜0.05），其与益气组、化瘀组、正常对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。糖尿病对照组sm ad2表达水平明显高于正常对照组（P＜0.05）；益气化瘀组sm ad2表达水平与各组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。糖尿病对照组sm ad3表达水平明显高于正常对照组（P＜0.05）；益气化瘀组sm ad3表达水平低于化瘀组（P＜0.05），明显低于糖尿病对照组、益气组（P＜0.01），高于正常对照组（P＜0.05）。

表1 各组ALK5、Smad2、Smad3比较±s）

表1 各组ALK5、Smad2、Smad3比较±s）

与正常对照组比较，①P＜0.05；与糖尿病对照组比较，②P＜0.05，③P＜0.01；与化瘀组比较，④P＜0.05；与益气组比较，⑤P＜0.01

组别益气化瘀组益气组化瘀组糖尿病对照组正常对照组n 8 8 8 8 8 ALK5 4215.59±1194.82②5205.97±1327.38 4878.53±1239.51 6720.21±2137.36①3210.52±767.67 Smad2 2351.63±629.05 2597.17±997.99 2611.01±1201.05 3384.09±1609.57①2056.53±195.06 Smad3 4283.12±1286.48①③④⑤6222.98±1270.56 6037.45±1663.62 8478.76±2147.60①1203.67±772.35

3 讨论

糖尿病溃疡属中医学溃疡、消渴等范畴。自20世纪60年代起，在传承全国中医外科大家顾伯华先生经验的基础上，笔者从中医理论、文献、临床和基础研究等方面，对中医药治疗糖尿病溃疡进行了系统、深入研究，取得了一系列丰硕的成果。提出糖尿病溃疡病机演变的特点为“因虚感邪，邪气致瘀，瘀阻伤正，化腐致损”，其中“虚”、“瘀”是创面难以愈合的主因。根据《医林改错》所述“元气既虚，必不能达于血管，血管无力，必停留而瘀”等中医药理论，建立“益气化瘀法”贯穿疾病治疗始终的新观点，确立了“益气化瘀法”的治疗法则和系列方剂，形成了“益气化瘀法治疗糖尿病溃疡”的学术思想体系，明显提高了糖尿病溃疡的临床疗效，同时一定程度上能缓解瘢痕形成，提高愈合质量［7］。

随着近年来分子生物学等学科的发展，对糖尿病创面愈合机制及瘢痕形成的研究日趋深入。增生性瘢痕是临床常见的病理性瘢痕，其病理基础是以成纤维细胞为主的细胞成分的过度增殖和以胶原为主的细胞外基质的过度沉积。TGF-β是一种重要的血管形成因子，具有广泛的生物学活性，在溃疡创面组织中含量的变化对溃疡发生、修复愈合发挥核心作用，同时TGF-β也是公认为最强的致纤维化因子，是影响瘢痕形成的关键因素［8～9］。TGF-β可能通过增加Ⅰ、Ⅲ型胶原（特别是Ⅰ型胶原）沉积，抑制胶原酶活性、促进纤维粘连蛋白（FN）表达等因素，促进细胞外基质沉积，导致组织纤维化，瘢痕形成［10］。Sm ads蛋白家族是细胞内特异转导TGF-β调控信息的信号转导分子，它们可将TGF-β信号直接从细胞膜转入细胞核内，并激活靶基因的转入［11～12］，目前已被公认为修复相关基因，与创面的愈合有密切的关系。ALK是TGF-β的Ⅰ型受体，与其配体结合传导信号。Sm ad是TGF-β的胞浆递质，参与TGF-β的信号传导。最新研究发现，TGF-β超家族信号传导有2条通路：一条是TGF-β/ALK1/Sm ad1/5途径，与新生血管形成有关；另一条是TGF-β/ALK5/Sm ad2/3途径，拮抗ALK1信号通道，并与纤维化有关［13］。对动物脏器纤维化模型研究结果表明，采用小分子抑制剂抑制ALK5活性可降低脏器中纤维化基因表达和胶原沉积，减少纤维化程度。

实验结果显示，糖尿病对照组ALK5/Sm ad2/3明显高于正常对照组，提示糖尿病性溃疡难以愈合及瘢痕形成的原因可能与之有关。益气化瘀组及其拆方组能不同程度的抑制ALK5/Sm ad2/3通路，且益气化瘀组更优于其拆方组。由此可以认为，抑制ALK5/Sm ad2/3通路可能是益气化瘀中药促进创面愈合，减少瘢痕形成的途径之一，初步印证了“补虚生肌”“化瘀生肌”的学术理论。同时，益气化瘀组更优于拆方组更进一步说明，益气法与化瘀法合用，能更大程度的逆转“因虚致瘀”“瘀阻伤正”的致损病机，更体现中医相须配伍的科学性。

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［10］王荣国，周卫，章永东.TGF-β促纤维化机制及中药干预的研究进展［J］.中国骨伤，2008，21（2）：161-163.

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［13］陈开容，李万成，黄旭晴.转化生长因子β/sm ad途径在血管生成和促纤维化中的作用及切换［J］.国际呼吸杂志，2009，29（4）：244-247.

（责任编辑：骆欢欢）

Effects o f Chinese Herbs o f Rep lenishing Qi and Reso lving Stagnation on Pathw ays o f TGF-β/ALK5/Sm ad2/3 o f Granu lation-p ro liferative Skin U lcers in Diabetic Rats

ZHANG Zhen，QUE Huafa

Objective：To explore the effect of Chinese herbs of replenishing qiand resolving stagnation on the pathw ays of TGF-β/ALK5/Sm ad2/3 of skin ulcers at granulation proliferative stage in diabetic rats.Methods：Fifty rats w ere random ly divided into five groups：replenishing qiand resolving stagnation（RQRS）group，replenishing qi（RQ）group，resolving stagnation（RS）group，diabetes control（DC）group，and norm al control（NC）group.Diabetes m odelw as induced by peritoneal injection of streptozotocin and skin ulcers w ere caused by surgery m ethod in rats.And then the expression of ALK5，Sm ad2 and Sm ad3 w as detected w ith the m ethod of W estern blotting.Results：The levels of ALK5/Sm ad3 of the DC group w ere higher than those of NC group.The levels of ALK5/Sm ad2/3 of all the m edication groups w ere low er than those in DC group，and those in RQRS group w ere low er than those in RQ and RS groups.Conclusion：The therapy of rep lenishing qiand resolving stagnation can accelerate the w ound healing and reduce the scar form ation probably bym odulating the pathw ays of TGF-β/ALK5/Smad2/3.

Diabetes mellitus；Ulcer；Therapy of rep lenishing qi and resolving stagnation；Pathw ays of TGF-β/ALK5/ Sm ad2/3

R587.2

A

0256-7415（2015）06-0270-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.06.127

2015-01-02

国家自然科学基金青年科学基金项目（81202698）；国家自然科学基金项目（81173266）；上海市海派中医传承研究项目（ZYSNXD-CC-APGC-JD002）

张臻（1977-），女，副主任医师，硕士研究生导师，研究方向：中医外科学。