Zebularine对肝癌细胞RASSF1A基因表达的影响

方勇

摘要：目的： 探讨Zebularine对人肝癌细胞RASSFIA基因启动子甲基化以及mRNA表达的影响。方法： 体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721，分别用0.5、1.0、 2.0、5.0μmol/L的Zebularine与之孵育72h。甲基化特异性PCR检测处理前后RASSFIA基因启动子甲基化水平。RT-PCR检测RASSF1A mRNA表达。结果 ： 随着药物浓度的增加，甲基化RASSFIA含量逐渐降低。而非甲基化产物逐渐增高。此外，Zebularine处理后，RASSF1A mRNA的含量也随之增高。结论： Zebularine可逆转SMMC-7721细胞株细胞中基因甲基化修饰状态。

关键词： Zebularine；肝癌细胞；RASSFIA基因；启动子甲基化

基金项目：湖南省自然科学衡阳联合基金（No.12JJ9033）；湖南省科技厅项目（No.2013SK3118、2014SK3081）；湖南省高校创新平台基金（No.10K052、12K094、13K083）；衡阳市科技局项目（No.2013KJ12、2013KJ28）

肝癌（liver cancer）是消化系统最常见的恶性肿瘤[1， 2]。虽然手术疗法是治疗肝癌的主要方式，但对于已转移至肝内或者肝外的肿瘤，迄今为止尚无理想的治疗方法[3， 4]。因此，寻求有效的的分子治疗靶点，从源头抑制肝癌的发生，是临床工作者不懈的追求。近年来，DNA异常甲基化在肿瘤的发生发展中的作用日益受到重视[5， 6]。RAS相关区域家族1A 基因（RASSF1A） 是一种新型的抑癌基因，位于人體3号染色体短臂。RASSFlA不仅和细胞调亡有关，同时也调控微管以及有丝分裂过程，并参与肿瘤的发生、发展。在多种肿瘤组织中，RASSF1A基因的表达降低或缺如[7]。这些研究结果表明RASSF1A是一种抑癌基因，RASSF1A的表达或者缺失可能是肿瘤发生的早期事件[8]。

Zebularine[1-（ B-D-呋喃核糖苷） -1，2-二氢嘧啶-2-酮]是一种新型的DNA 甲基转移酶（ DNA methyltransferase，DNMT） 抑制剂，可抑制后者甲基化作用从而对多种肿瘤具有抑制作用。本研究旨在观察Zebularine对肝癌细胞RASSF1A基因表达的影响。

1.材料与方法

1.1 主要试剂

Zebularine购自Sigma。SMMC-7721细胞购自中国典型培养物保存中心。基因组DNA小量抽提试剂盒购自碧云天生物技术研究所。EZDNA甲基化试剂盒为北京天漠科技开发有限公司。Rnase Inhibitor、 dNTP，MULV酶购自TAKARA。人RASSFIA基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 细胞培养与处理

人肝癌细胞株SMMC-7721细胞接种于37℃、5% CO2环境中培养。待细胞贴壁并且铺满瓶底面积的80%左右时，分别用0.5、 5.0、30、50.0μmol/L的Zebularine培养72h。

1.3 甲基化PCR

按照试剂盒提供的步骤获取细胞基因组，随后分别并对其进行甲基化和亚硫酸氢钠修饰处理。即，制备胞嘧啶-尿嘧啶转换溶液，加入1μg DNA样品后置于98℃ 10min，64℃ 2.5h后，4℃储存6h。加入600μl结合缓冲液到离心柱中，离心洗脱DNA，-20℃保存备用。本文所用到的引物分别为：甲基化引物：5-GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3， 5-GCTAACAAACGCGAACCG-3。非甲基化引物：5-GGTTTTGTGAGAGTGTGITAGG-3， 5-一CACTCAAACACAAACCAAAC-3。

1.4 RNA提取与RT-PCR

采用Trizol提取RNA，并根据试剂盒提供的步骤进行RT-PCR。RASSF1A的引物序列： 5′-TGG GAG ACA CCT GAC CTT TC-3′（上游）和5′-TGG GCA GGT AAA AGG AAG TG-3′（下游），扩增产物长度为229bp。β-actin：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′（上游）和5-GTCCTrAATGTCACGCACGATTTC-3 （下游），扩增产物410bp。逆转录参照TaKaRa 公司试剂盒说明书进行。PCR条件；95℃ 5min， 94℃ 30s，53℃ 40s， 72℃ 30s，进行40个循环，最后一个循环72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，并在图像分析系统上进行密度扫描，用RASSF1A基因扩增产物的密度与β-actin基因扩增产物的密度比值表示基因表达水平。

1.5 统计学分析

采用SPSS 15.0 统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差表示，多组比较采用one-way方差分析并行Students t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Zebularine处理对RASSF1A甲基化的影响

甲基化PCR显示，SMMC-7721细胞经0.5μmol/L Zebularine处理48h后，即可明显降低甲基化RASSF1A的表达水平，且随着Zebularine浓度的增加，甲基化RASSF1A逐渐降低，非甲基化产物逐渐升高，见表1。

2.2 Zebularine于不同时间影响细胞内甲基化和非甲基化RASSF1A含量

SMMC-7721细胞经5.0 μmol/L Zebularine作用0～48h，MSP结果显示，随着时间的延长，细胞中非甲基化RASSF1A基因表达水平较低，相对应的，甲基化RASSF1水平逐渐增多（表2）。

2.3 Zebularine增加SMMC-7721细胞RASSF1A mRNA表达

SMMC-7721细胞中RASSF1A mRNA含量低下。而经不同浓度Zebularine处理48h后，RT-PCR结果显示RASSF1A mRNA水平随之增高，其中5.0μmol/L Zebularine处理后RASSF1A mRNA增加了3.6倍。

2.4 Zebularine作用不同时间影响RASSF1A mRNA表达

采用5.0μmol/L Zebularine作用SMMC-7721细胞0～48h，RT-PCR检测RASSF1A mRNA表达含量。结果显示，Zebularine作用12h后RASSF1A mRNA增加了1.6倍，随着时间的延长，RASSF1A mRNA表达量逐渐增高，48h后增加到3.4倍。

3 讨论

RASSF1A是一种目前已经得到公认的抑癌基因，该基因的缺失、突变或低表达参与了多种肿瘤的发生发展。目前已经明确的机制主要包括调控细胞周期、降低有丝分裂、诱导调亡和抑制细胞增殖等。研究发现肝癌细胞中RASSF1A基因表达低下，且在肝癌组织中，RASSF1A抑癌基因处于高甲基化状态[9]。国内学者江小杰等[10]在通过检测肝癌组织中RASSF1A基因的表达水平后证实：在肝癌组织中，RASSF1A表达量明显下调。而癌旁正常组织中RASSF1A mRNA水平是肝癌组织中的3倍以上。本研究中我们通过不同浓度的Zebularine处理肝癌SMMC-7721细胞株，于不同的时间点检测SMMC-7721细胞RASSF1A转录mRNA翻译蛋白的变化情况。结果显示，Zebularine处理肝癌SMMC-7721细胞株后， SMMC-7721细胞经RASSF1A mRNA表达显著增高。同时，本研究也证实Zebularine也能以时间依赖性方式下调甲基化RASSF1A的水平及上调mRNA的表达。

RASSF1A基因失活机制很多，目前广泛认可的机制是由于RASSF1A基因启动子区域CpG岛发生异常甲基化而造成的。赵强子[11]等使用甲基化抑制剂Zebularine处理RASSF1A表达异常的肝癌细胞株SMMC-7721细胞后，可以观察到RASSF1A的重新表达，提示甲基化抑制剂有望成为肝癌治疗的新选择。为了进一步检测肝癌SMMC-7721细胞RASSF1A基因甲基化状态及Zebularine能否影响其甲基化水平。本研究采用甲基化特异性PCR（MSP）对其甲基化状况进行了分析。结果显示：空白组 RASSF1A 基因启动子区域可明显扩增出甲基化产物，而未甲基化RASSF1A表达水平很低。表明肝癌SMMC-7721 细胞 RASSF1A 基因呈甲基化状态，经Zebularine作用48h后，肝癌 SMMC-7721 细胞 RASSF1A 基因启动子甲基化产物降低，而未甲基化引物扩增产物增高。说明紫Zebularine能有效逆转肝癌 SMMC-7721 细胞RASSF1A 基因启动子区甲基化状态，打破基因表达沉默现象，并再次编码翻译蛋白，该蛋白能减少肝癌细胞增殖生长，这表明RASSHA基因存在高甲基化存在于肝癌细胞中，且高甲基化的修饰作用能减少RASSF1A抑癌基因的表达。此外，这种DNA甲基化状态是可逆的，能被Zebularine去甲基化。

参考文献：

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[7]Jain S， Xie L， Boldbaatar B， et al. Differential methylation of the promoter and first exon of the RASSF1A gene in hepatocarcinogenesis[J]. Hepatol Res， 2014.

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[10]江小杰， 李建国， 王晓亮. RASSF1A mRNA在原发性肝癌中的表达及其临床意义[J]. 中华实验外科杂志， 2010，27（12）：1838-1840.

[11]赵强子. 原发性肝癌RASSF1A异常甲基化及其功能的初步实验研究. 见：窦科峰，主编. 外科学. ，2006.