括苍山叶栖酵母菌资源的研究

金亚倩　胡琼会　王雪奇

【摘要】在本次实验研究中，在括苍山上符合要求的不同区域进行树叶采集，之后分离出酵母菌，纯化后再用简单法提取酵母菌DNA，PCR扩增26S rDNA D1/D2区，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序，实验结果初步阐明了括苍山野生环境中叶栖酵母菌资源的种类概况。

【关键词】酵母菌；括苍山；26S rDNA D1/D2；分布

引言：

酵母菌是一种单细胞微生物，属于真菌类，结构简单，可以通过出芽方式发生无性繁殖，也可以形成子囊孢子进行有性繁殖。目前已经发现的超过1000多种。酵母菌喜爱潮湿、含有糖分的各种物体表面生活，例如土壤、果皮表层、植物表面，甚至空气当中也存在。酵母菌具有很多特性，在食品生产中、环境保护、工业及科学研究方面等都普遍应用。

一、本实验采样地点

本实验的采样地点是在浙江省临海市括苍山，位于浙江中部沿海，属亚热带季风气候，温暖湿润、四季分明。考虑到本次实验以发掘寻找新的酵母菌种为目的，故采样地点选择人烟稀少的区域，减少人类活动对酵母菌分布带来的影响，同时尽可能增大横向空间距离，提高新酵母菌发现的可能性。

二、采样方法

本次实验采样采用无菌塑料袋进行无菌采样，样品主要为生长成熟的老树叶，叶子在树上生长时间越久越好，刚刚从树上飘落下来的为最佳。对叶子的种类没有特殊要求，可以在不同地理位置选择同一种类的植物，同一株植物从不同高度采集数片叶子，再隔一段距离进行下一次采集，要保持一定的横向距离。采集样品时，一手持着无菌塑料袋，另一只手用剪刀将树叶剪下来放入袋中，装好后立马扎紧袋口，尽量保证取样过程满足无菌要求。对采集的样品逐一编号并写上植物的名称。

三、酵母菌的分离和保存

（一）培养基

菌种的分离和斜面均采用PDA固体培养基培养。使用前加入30μg/ml的青霉素，减少霉菌等的干扰。

PDA培养基又叫马铃薯培养基，配方如下：马铃薯 200g，葡萄糖或蔗糖 20g，琼脂 15-20g，水1000ml，pH值无需调节。配制过程如下：

①称量和熬煮。计算出药品的实际用量，马铃薯去掉表皮称取200g，用小刀切成适当的块状放入锅中，加水1000ml。在加热炉上加热至沸腾，期间稍加晃动几次锅防止粘锅，沸腾后持续加热30min。用双层的纱布在量杯上过滤，剩下的滤渣倒掉，滤液用水补充到1000ml。

②滤液倒入锅中，加入蔗糖20g，琼脂20g，搅拌均匀。

③将配制的培养基分装到500ml的三角瓶或试管中。

④加塞，包扎。为防止外界环境中的微生物进入试管或三角瓶污染培养基。分装完成后，每个试管口和三角瓶口塞上棉塞，用旧报纸包好并用橡皮筋捆紧，防止灭菌时冷凝水湿润棉塞而影响实验结果。

⑤灭菌。将加塞包扎过的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中，在121℃条件下灭菌30min。灭菌完成后取出培养基冷却一段时间。

⑥倒平板。灭菌后的试管摆斜面，斜面的长度不能超过试管长度的1/2。灭菌的三角瓶冷却到一定温度，加入一定量的青霉素，提高培养基的抗菌能力，特别是抗细菌能力，有利于真菌分离。然后在无菌操作台上倒平板，每个平板倒约20ml的培养基。

（二）酵母菌分离

①准备与样品数量相同的培养皿，分组，用旧报纸包好并用橡皮筋扎紧。将包装好的培养皿用高压蒸汽灭菌锅在121℃条件下灭菌30分钟。

②灭菌完成后将培养皿放入干燥机干燥待用。（干燥机需在有人看管情况下使用防止发生安全事故）

③双手洗净，用酒精棉消毒。在无菌操作台上，将采摘的叶子逐一取出来取适量大小用凡士林粘在培养皿盖上并一一记号。完成后的树叶培养皿放置在实验台上静置一天。

④，将昨天的树叶培养皿盖在无菌操作台上换至有有培养基的培养皿上。放入培养箱一天。

⑤无菌条件下，将第二次粘有树叶的培养皿盖换至新的培养基上。第一次的培养基一一标上编号，倒置培养，树叶培养基正放培养。

（三）酵母菌纯化

①取出所有的酵母菌培養皿，去掉无酵母菌的培养基。

②涂布。在无菌条件下，取培养基上的酵母菌在新的培养皿上涂线，一个培养皿涂两种菌，尽可能地取多种菌，各自在培养皿底编号，放入培养箱倒置培养。培养两天。

四、酵母菌DNA提取

采用简单法提取酵母菌（用于D1/D2和ITS区序列分析），具体方法参照Makimura et al进行。

①取1.5mL离心管，加入100μL裂解液，用无菌接种环取少量新活化菌体（1环）混匀。

②100℃条件下水浴15min，冷却后加入100μL的2.5M醋酸钾，用手甩几次摇晃均匀，放置于冰上0.5h（此时离心机开始预冷）。

③在4℃、13000rpm条件下离心10min，上清液（大约170μL）移至新的灭菌1.5mL离心管内。

④加等体积（大约170μL）的氯仿-异丙醇（24：1），颠倒离心管剧烈震荡约10min，然后在13000rpm离心15min，移取上清液（约100μL）至另一1.5mL离心管。

⑤加入等体积预冷异丙醇，手甩几次混匀后在-20℃下静置15min；4℃、13000rpm条件下离心10min，倒掉上清液，同时打开35摄氏度烘干箱备用。

⑥用100μL的70%乙醇洗涤沉淀，轻甩后放置10min，4℃、13000rpm条件下离心10min。

⑦弃掉上清液，离心管倒扣在纸上数次，并用小块纸吸去残水，开盖向上过夜自然干燥。

⑧加入50μL已灭菌的双蒸水，室温下溶解30min，放于-20℃冷藏备用。

五、琼脂糖凝胶电泳

对PCR扩增的原液样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳是核酸分析常用的技术，在此次实验中对酵母菌核酸分析中也是重要的步骤，主要步骤如下：

1%琼脂糖凝胶配制：1g琼脂糖+100ml1×TAE， 使用微波炉加热使琼脂糖均匀溶解。待凝胶温度降至50℃后加入EB液。等到温度不烫手后将凝胶溶液缓慢倒在电泳凝胶板上，去掉里面的气泡。等到凝胶固定后将点样梳取出来。电泳槽内加入电泳缓冲液，胶板放到电泳槽中，有点样孔的这一头要靠近电泳槽的负极，缓冲液要盖过胶面。连接电源，开始电泳，75V电泳10至15min。

六、结论

此次从临海市括苍山上采集的树叶中分离得到38种菌株，经过26S rDNA D1/D2区序列分析，根据搜索得到的结果，可以确定011菌株为Derxomyces mrakii、014菌株为Tremellales sp.、022菌株为Sporobolomyces sp.、023菌株为Sporobolomyces ogasawarensis、031菌株为Sporobolomyces oryzicola、032菌株为Sporobolomyces carnicolor、037菌株为Bullera pseudovariabilis。因此可以得知，括苍山区域内至少存在以上七种酵母菌。在研究过程中也发现了疑似新的酵母菌物种。临海市括苍山植物上的叶栖酵母菌资源，值得进一步研究。

参考文献

[1] 曹文平， 武晓刚， 郭.， etc. 酵母菌在废水处理中的应用现状和进展. 中国生物工程杂志. 2007， 27 （11）： 99–104 [2011-08-25].

[2] 张翠，刘亚民，张忠玲，梁浩，黄海燕，宋长征. Taq DNA聚合酶及镁离子浓度对PCR扩增产率的影响. 国外医学：临床生物化学与检验学分册 2003年 第4期

[3] 郭玉莲，PCR技术的原理及其应用[J].才智. 2008（18）：230-234

作者简介：金亚倩（1992年-），浙江台州人，台州市绿科检测技术有限公司，综合部，负责商务。