锌污染对五节芒的膜脂过氧化水平及抗氧化能力的影响

晏洪铃　罗琳　李雅贞　罗惠莉　毛石花

摘要：对Zn胁迫下五节芒叶部和根部内过氧化产物丙二醛（MDA）的含量以及多酚氧化酶（PPO）、超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性进行了研究。结果表明：叶部和根内MDA活性伴随着Zn胁迫强度的增大而升高，膜脂过氧化水平上升。作为植物抗氧化系统中的关键酶，随着Zn浓度的增加，SOD活性呈现出先上升后下降的两阶段反应，从而说明了Zn的污染超出了植物所能承受的防护阈值，使得其防御能力相应减弱，甚至死亡。PPO活性的下降说明在重金属的伤害下五节芒的抗逆性减弱。而POD活性高于对照说明在重金属胁迫下五节芒植株体内的抗氧化能力增强。由此可见在Zn污染下导致植物被伤害的主要原因是细胞内O2浓度的升高带来的膜脂过氧化水平的增强，而植物体内的保护酶系统SOD、POD和PPO活性的变化则可能是五节芒抗过氧化的机理之一。

关键词：锌；五节芒；酶；抗氧化能力

中图分类号：S 688；X 173文献标识码：A文章编号：1001-005X（2015）01-0001-05

MDA Accumulation and Antioxidation Capacity of

Miscanthus Floridulus Under Zn Stress

Yan Hongling，Luo Lin*，Li Yazhen，Luo Huili，Mao Shihua

（College of Resources and Environment，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）

Abstract：The content of peroxidation product malondialdehyde（MDA）and activity of polyphenol oxidase（PPO），superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD）in the miscanthus leaves and roots under the Zn stress were studied in the paper.The results showed that under the Zn stress，O2 in leaf and root accumulated，and the activity of MDA increased with the increase of Zn stress and a defensive system was started inside the cell with the rising of membrane lipid peroxidation levels.As the key enzyme in the plant antioxidant system，the activity of SOD showed a two stage reaction which increased at first and then decreased as Zn stress increased，which indicated that the stress exceeded the threshold of the plant and its defense diminished correspondingly and even caused the death of the plant.The decrease of the activity of PPO indicated that miscanthus adverse resistance decreased under the pollution of heavy metal.The research showed that activity of POD was higher than the standard value，which means that the antioxidant capacity of miscanthus enhanced under the heavy metal stress.It is concluded that the main reason why the heavy metals are harmful to plants is that membrane lipid peroxidation enhanced due to the increase of O2concentration in the cell under the heavy metal pollution，while the increase of the activity of protective enzyme system SOD and POD is just one of the miscanthus antiperoxidation mechanisms.

Keywords： zinc（Zn）；miscanthus floridulus；enzyme；antioxidation capacity

引文格式：晏洪鈴，罗琳，李雅贞，等.锌污染对五节芒的膜脂过氧化水平及抗氧化能力的影响[J].森林工程，2015，31（1）：1-5.随着全球环境的不断恶化，重金属对土壤和水体的污染问题正得到越来越多的关注[1-2]。Cd，Cu，Zn等重金属对土壤的污染严重破坏了我国的生态环境，阻碍了农业的可持续化发展，同时还可能被作物吸收，通过食物链危及到人类健康[3-4]，因此，研究植株在面对重金属污染下的防御机理，不仅为保持生物多样性，保护生物圈提供了重要的理论基础，也为保持农业安全、优质、高效生产提供了科学的依据[5]。

Zn是植物生长的必需营养元素，在正常生长情况下，植物对Zn 的吸收主要表现在受代谢控制的主动吸收过程。目前有关Zn胁迫对植物造成影响及危害的研究很多，但大都集中于研究Zn胁迫对植物新陈代谢和生长发育的影响，而对植物耐Zn胁迫的机理研究很少，且其研究对象主要是普通植物。本文中所研究是植物是五节芒，它是禾本科芒属多年生草本植物，根系发达，因其侵袭，竞争力强，且具有很好的生长繁殖及生态适应能力，因此常常成为林缘、滩涂、丘陵和山地等草本群落的优势群体，对防止表土流失、山体滑坡、截流雨水及涵养水源等方面具有重要的作用，因此在生态水土保持方面具有重要意义[6]，而且对矿区环境具有很强的耐性，能在金属矿区废弃地形成优势种群[7-8]。研究表明，在重金属矿业废弃地，五节芒在对恢复生态实践中具有较大的应用潜力，它不仅能促进尾矿砂重金属朝着螯合态和沉淀态方面进行转化，还能对改善尾矿砂微生物群落的功能发挥作用。虽然五节芒不属于重金属超富集类植物，但是对污染土壤中的锌具有较强的吸附能力，这一现象说明五节芒对降低污染土壤中重金属锌的含量以及改善土壤环境具有很大的价值。本文主要对五节芒抗重金属污染机理尤其是重金属污染后五节芒体内膜脂过氧化水平以及保护酶活性的变化特性进行了研究和分析。

第1期晏洪铃等：锌污染对五节芒的膜脂过氧化水平及抗氧化能力的影响

森林工程第31卷

1材料及方法

1.1植物材料

供试植物为五节芒，禾本科碳四芒植物，生物量大，分布地域广，适应环境能力强；盆栽实验五节芒来自湖南农业大学园艺园林学院芒属植物资源库；品种为芒狄属杂交五节芒。

1.2土壤培养

本实验采用在盆栽里模拟添加重金属来进行实验。重金属污染的土壤，采自湖南农业大学资源环境学院农田土。各供试土壤的重金属含量及理化性质见表1，土壤中锌的环境质量标准见表2。

1.2.1原始土壤

取自湖南农业大学资源环境学院农田土，土壤基本性质见表1。

表1供试土壤理化性状

Tab.1 Physical and chemical properties of tested soil

土壤pH有效磷

/mg·kg-1OM-1）

/g·kg-1全Zn

/mg·kg-1有效Zn

/mg·kg-1模拟土4.8790.611.094206.741.42

1.2.2模拟制备的污染土壤

每千克土添加5 g 尿素溶于水后分别与Zn2+溶液一起喷洒在土壤中拌匀后装盆。外源 Zn2+添加量为0、300、600、1000、1 500 mg/kg。以不添加Zn2+为对照。每处理重复3次。

1.3测定方法

1.3.1过氧化物酶活性测定（POD）（愈创木酚法）

采用愈创木酚法[9]：反应体系为0.1 mL酶液，2.9 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液，1.0 mL 0.05 mol/L愈创木酚以及1.0 mL 2%H2O2。将酶液加热煮5 min作为对照组。加入酶液后，迅速放入34℃的水浴锅内保温3 min，然后马上进行稀释，稀释比例为1∶2。在470 nm下进行比色，记录间隔为1 min，取每分钟内A470变化0.01为一个酶活性单位。

1.3.2植物細胞膜脂过氧化作用的测定（MDA）

取五节芒新鲜的根叶样本，将样本剪碎，称取1 g作为试材，加入2 mL 10%的TCA，同时加入少量石英砂帮助研磨，将材料研磨至匀浆后接着加入8mL TCA进一步进行研磨。将研磨充分的匀浆放在离心机里在3000rmp条件下离心10min，取离心后的上清液作为样本提取液。取4mL样本提取液，加入4mL 0.6%的TBA（硫代巴比妥酸）混合均匀，然后在100℃的水浴上煮沸15 min，冷却后再一次离心。分别测定上清液在450、532、600 nm处的吸光度值。所有指标均需平行重复测定3次以上。

1.3.3超氧化物歧化酶活性的测定（SOD）

采用氮蓝四唑（NBT）法[10]：取透明度好、质地相同的试管3组，1组用于测定，2组用于对照，反应体系含750μmol/L氮蓝四唑（NBT）、130mmol/L甲硫氨酸（Met）、20μmol/L核黄素、100μmol/EDTA-Na2、各0.3mL、0.05mol/L的pH 7.8磷酸缓冲液1.5 mL、待测酶液0.5 mL（对照管以缓冲液代替酶液）、蒸馏水0.25 mL，共计3 mL，混合均匀，将1组对照试管放于暗处，其他各组同时置于4000Ix日光灯下反应30 min。至反应结束时，以未照光的对照组作为空白，分别在560 nm下测定各管的吸光度。取抑制光还原NBT50%为一个酶活性单位。

1.3.4多酚氧化酶活性的测定（PPO）

PPO是植物体内的一种含酮氧化酶。制备酶液样品：取五节芒新鲜根叶样本各2 g，加入少量石英砂加水研磨成浆，水洗匀浆转入50 mL容量瓶，定容，摇匀后至于水浴锅（25℃）中预热备用。同时将试剂抗坏血酸、邻苯二酚和磷酸缓冲液放入水浴中预热。

测定：选取100 mL的三角瓶，先后吸取预热试剂磷酸缓冲液1 mL，抗坏血酸5 mL，邻苯二酚5 mL，再加入酶液5 mL，计时并均匀振荡2 min，然后再加入偏磷酸5 mL以终止反应，并加入0.5%淀粉液1 mL作指示剂，用0.01 mol/L碘酸钾滴定至浅蓝色不变，同时做空白对照。

2结果与分析

2.1锌胁迫对超氧化物歧化酶活性（SOD）的影响

SOD是活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，能将O2-快速歧化为H2O2和分子氧；该酶的活性决定了O2-和H2O2的浓度，而两者均为HaberWeiss反应的底物，因此SOD是保护机制的中心，其作用是清除氧自由基，防止氧自由基破坏细胞的组成、结构及功能，保护细胞免受损伤。SOD活性与植物抗逆性密切相关，它是防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害。由图1来看，在锌污染的环境下，五节芒根部SOD活性整体上高于叶部；同时五节芒叶部和根部的SOD均随着胁迫的增强呈先升高后下降的趋势，这种趋势在根部中表现的较为平缓，在叶部中表现的相对更明显；而当锌浓度到900mg/kg处理水平时达到最高，大于1 500 mg/kg时，SOD酶活性表现下降趋势。

图1不同浓度重金属Zn胁迫下五节芒

SOD酶活性的比较

Fig.1 Effect of Zn concentration stress on SOD enzyme activity

SOD 被证明具有控制膜质过氧化水平，保护膜系统的结构和功能的作用。SOD能催化超氧化物自由基阴离子（O2-）歧化作用，亦是活性氧清除体系中的关键酶，其主要作用是O2-转化为H2O2 和水，五节芒在Zn的胁迫下，Zn离子进入其细胞膜，致使脂质易发生氧化作用，产生有害的自由基，而SOD能限制自由基对细胞的损害。实验表明，经过300mg/kg Zn处理后，五节芒叶片内的SOD活性表现为先上升后下降的两阶段反应，这正是植物应对胁迫反应的典型特征，也就是说，当植物遭到胁迫时，会采取各种措施以应对环境的恶化，提高自身抗性以适应不良的环境，但是如果这种胁迫持续的时间过长或胁迫程度过大，超过了植物所能忍耐的极限，它们的防御措施就会相应减弱，甚至死亡。

所以在中低离子浓度以下，Zn离子先对细胞产生了伤害，五节芒随之启动防卫系统，SOD活性增高，开始清除自由基，保护细胞不受伤害。当Zn离子浓度高于900 mg/kg 时，对细胞的伤害超过其自我保护范围，保护失败，SOD活性不再上升，随着处理浓度的增加反倒呈现下降的趋势，说明在高浓度下随培养时间增加，体内重金属离子累积，对植物造成伤害不可修复。

2.2锌胁迫对过氧化物酶活性（POD）的影响

POD是一类活性较高的酶，与呼吸作用、光合作用等有密切关系，它可以反应某一时期植物体内代谢的变化。POD是广泛存在于植物的各器官组织中的氧化还原酶类之一，其与许多生理代谢过程有关，与细胞的分化和生长有着密切的关系，直接影响到植物的生长和发育[11]。POD是植物体内消除自由基伤害防护酶系成员之一，特别是在活性氧代谢过程中发挥了重要的作用。POD 可使生物活性氧维持在一个低水平上，防止活性氧的伤害，此酶活性与植物的代谢强度有着密切关系。许多研究表明，在重金属胁迫下，植物叶片的POD 活性增强[12]。图2表明在重金属Zn的胁迫下，五节芒根部和叶部的SOD均随着胁迫的增强呈升高的趋势；在受到Zn胁迫后，根部POD活性显著增加，各处理浓度组的POD活性分别为对照组的126.4%、207.6%、332.5%、430.5%，在叶部中各处理浓度组POD活性分别为对照组的114.6%、162.9%、227.0%、309.3%，五节芒根部的POD活性明显高于叶部。

SOD 和POD都是细胞内清除活性氧系统中的重要酶。SOD 能将O2-歧化为H2O2，抑制HaberWeiss 反应，POD 能将H2O2进一步分解成为H2O，从而将有毒的超氧阴离子转变成为无毒的H2O，使细胞内自由基维持在一个较低的水平，令其无法对细胞造成毒害。本研究表明，POD活性随重金属Zn污染浓度强度的增加而增加，这可能是五节芒对重金属Zn胁迫的应激反应，是属于植物的一种自我保护。在中低离子浓度以下，Zn離子先对细胞产生了伤害，五节芒随之启动防卫系统，POD 活性增高，开始清除自由基，保护细胞不受伤害。

图2添加重金属对五节芒POD的影响

Fig.2 Effect of Zn addition concentration

on POD of miscanthus floridulus

图3添加重金属Zn对五节芒MDA的影响

Fig.3 Effect of Zn addition concentration

on MDA of miscanthus floridulus

2.3锌胁迫对植物细胞膜脂过氧化作用（MDA）的

影响MDA膜脂过氧化作用是在植物在逆境遭受伤害时常常发生的，其中丙二醛是常用的膜脂过氧化作用的指标，这一产物从膜上释放出来后，可以与蛋白质等大分子结构发生交联反应，也可使纤维素分子键松弛、抑制蛋白的合成等，研究MDA的含量变化可以揭示植物膜脂过氧化水平及污染对植物细胞膜的伤害程度。从图3可知五节芒叶片的MDA水平明显的高于根部的MDA水平，且均随胁迫增强而增加。在受到Zn胁迫后，根部MDA活性变化表现的比较平缓，各处理浓度组的MDA活性分别为对照组的126.8%、127.6%、124.4%、131.7%，而在叶部中各处理浓度组MDA活性分别为对照组的212.5%、247.9%、315.1%、417.5%，这说明在污染环境下，五节芒的叶部细胞膜都受到的伤害远大于根部；在锌污染的土壤中，发现叶片中的MDA水平最高可达4.48 μmol/g，与对照相比MDA含量高出3.41 μmol/g，可知在Zn浓度为1 500 mg/kg的胁迫下，五节芒的细胞膜伤害程度。本实验结果表明在Zn的胁迫下，五节芒叶部和根部中伴随着O2-积累，膜透性增大，MDA含量升高，说明O2-破坏了细胞膜的结构，使细胞膜的结构发生了变化，这揭示了植株细胞膜系统在Zn胁迫下受到伤害的机制，证明了在Zn胁迫下，过多的自由基积累而引起的膜脂过氧化反应是植物受到伤害的主要原因。

膜质过氧化是膜上不饱和脂肪酸中所发生的一系列活性氧反应，其最重要的产物丙二醛（MDA），是一种高活性的脂质过氧化产物，会引起核酸、蛋白质、糖类和脂类等生命大分子的交联聚合，并破坏膜的结构，同时导致细胞质膜受到损伤，电解质严重渗漏。在正常的生长环境下，植物体内活性氧的产生与消除处于动态平衡状态，自由基浓度较低，不会对植物造成伤害。但是当植物处于衰老或各种逆境胁迫条件下时，这种动态平衡就会被打破，活性氧产生并积累.，当其浓度超过一定阈值时，植物细胞内的大分子物质会发生过氧化反应，膜脂中的不饱和脂肪酸受到自由基的攻击，引起膜脂相分离，膜的完整性受到破坏，从而导致植物生长异常[13]。本实验结果表明在Zn的胁迫下，五节芒叶部和根部中伴随着O2-积累，膜透性增大，MDA 含量升高，说明O2-破坏了细胞膜的结构，使细胞膜的结构发生了变化，这揭示了植株细胞膜系统在Zn胁迫下受到伤害的机制，证明了在Zn毒害植物的过程中胁迫下，过多的自由基积累而引起的膜脂过氧化反应充当了重要的角色是植物受到伤害的主要原因。

2.4锌胁迫对多酚氧化酶（PPO）的影响

多酚氧化酶（PPO）是植物体内普遍存在的一种含铜的氧化酶，它的活性大小是根据醌类物质的生成速度所氧化的抗坏血酸的数量推算出来的，PPO与呼吸作用有密切关系。由图4可知，重金属胁迫对叶片的伤害远远大于根部的影响，在Zn污染下，根部和叶部PPO活性均表现出下降，与污染强度呈负相关。

图4重金属胁迫下对五节芒PPO活性的影响

Fig.4 Effect of Zn addition concentration

on PPO of miscanthus floridulus

在以往重金属对植物胁迫的研究中，PPO很少被提及，杨居荣等[14]发现大豆、黄瓜和玉米等作物的PPO 活性会因受Cd 的胁迫而下降。本研究表明五节芒植物体内PPO活性随Zn处理浓度的增加也表现下降的趋势。在Zn浓度为1 500mg/kg的污染浓度下，叶部和根部PPO活性下降到6.588、4.957μmol/g·min，与对照相比下降了69.05%、67.92%，可见叶部对Zn的胁迫更加敏感。由于植物系统获得抗性的产生与防御相关酶——PPO有着密切的正相关关系，这种酶活性的提高是产生抗性的生理生化基础。在研究中，叶部和根部的活性随胁迫的增加而下降，说明植物体内随着外界危害不断增加，自身的抗性在不断减弱，当伤害突破植物承受的极限时，植物很可能会因为Zn离子在体内的累计，以及自由基离子不能及时清除而导致死亡。

3讨论

植物体内的活性氧（AOS）对植物细胞结构、功能、生物大分子、酶系统、DNA 均有一定的伤害作用[15]。当体内活性氧清除酶量不足或者活性太低时，就会有活性氧积累[16]。逆境诱导也会引起植物体内活性氧增加，产生的氧化胁迫可导致植物的不可逆损伤。然而植物在长期进化过程中，形成了一个完整的防卫系统，使植物细胞体内产生活性氧与清除活性氧维持动态平衡[17]，当动态平衡被打破时，植物细胞的结构和功能就会受到损伤，甚至造成植物体死亡。

总体而言，当Zn污染浓度小于某一临界（900mg/kg）时，Zn胁迫强度的增加对SOD酶活性有一定的促进作用，而当Zn浓度大于900mg/kg时，SOD酶活性表现下降趋势。达到极限后活性减弱，SOD限制自由基对细胞损害的能力下降。POD活性随着Zn添加强度的增加而增高，在一定程度上可以缓解植物细胞内膜脂过氧化水平的程度。尽管两种保护酶活性在临界范围内与胁迫强度呈正相关，但是随着植物体内O2-的积累、MDA 含量也随胁迫强度的增加而升高，从而导致产生的自由基总产生量扣除清除的自由基总量后净余量还是在不断上升，这说明SOD 和POD在一定限度内对膜系统可以起到保护作用，但是当保护酶活性的升高不足以弥补膜脂过氧化作用所带来的伤害植物就会受到损伤。可见，在Zn污染下细胞内O2-浓度升高带来的膜脂过氧化增强可能是植物受到伤害的主要原因，PPO活性的下降说明在Zn的伤害下五节芒的抗逆性在逐步减弱，而植物体内的保护酶系统SOD和POD活性的变化则可能是五节芒抗过氧化的机理之一。

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[责任编辑：刘美爽]