不同种源铁皮石斛生物学性状和糖类成分比较

罗海斌　李春牛　卢家仕　屈婷婷　曾宋君　卜朝阳

摘 要 为筛选出适宜在广西南宁地区种植的优良铁皮石斛种源，并为下一步筛选优良品系和遗传育种提供参考依据。以5种不同种源铁皮石斛为试验材料，在南宁地区引种栽培2 a后，观察其生物学性状，测定叶绿素和糖类含量。结果发现：不同种源地的铁皮石斛生物学性状、叶绿素和糖类含量均呈现出差异；云南河口铁皮石斛生物学性状表现良好，叶绿素含量中等，但多糖和甘露糖含量较低。浙江乐清种源株高最矮，叶面积最小，叶绿素含量最低，但多糖含量较高，甘露糖含量中等。广西桂平铁皮石斛茎较粗，叶片宽大，叶绿素含量、多糖含量中等，甘露糖含量最高。广西玉林和桂平铁皮石斛生物学性状相近，多糖含量最高，甘露糖含量较低；广西乐业铁皮石斛茎细，叶片狭长，叶绿素含量最高，多糖和甘露糖较高。说明广西桂平和广西乐业2个种源在南宁地区的适应性较好，品质较高，适宜推广种植。

关键词 铁皮石斛；生物学性状；糖类含量

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract In order to select the suitable varieties of Dendrobium officinale to cultivate in Nanning area and provide information for screening excellent varieties and genetic breeding. Five different germplasm resources of D. officinale were introduced and cultured in Nanning City in Guangxi. The biological characters， chlorophyll contents and saccharides components of them after two years planting were studied. The study found that the five Dendrobium officinale from different origins had different biological characters， chlorophyll contents and saccharides components. The biological characteristics of the D. officinale in Hekou City in Yunnan was good， its content of chlorophyll was medium， but its content of polysaccharide and mannitol was low. The plant height of the D. officinale in Yueqing City in Zhejiang was the shortest. Its leaf area was the smallest and the content of chlorophyll was the lowest，but the content of polysaccharide was higher and the content of mannose was medium. The stem of the D. officinale in Guiping City in Guangxi was thick. Its leaf area was large， the content of chlorophyll and polysaccharide was medium， but the content of mannose was the highest. The biological characteristics of the D. officinale in Yulin city and Leye city in Guangxi was close. The content of polysaccharide was the highest， but the content of mannose was lower. The stem of the D. officinale in Leye City in Guangxi was the thinnest. Its leaf area was narrow， the content of chlorophyll was the hightest and the content of polysaccharide and mannose was high. The results showed that the two germplasm resources of D. officinale in Guiping City in Guangxi and in Leye City in Guangxi had better adaptability and were suitable to plant in Nanning area.

Key words Dendrobium officinale；Biological characteristics；Saccharides component

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.020

铁皮石斛（Dendrobium officinale kimura et migo）属于兰科石斛属植物，在中国安徽、浙江、福建、广西、四川、云南等地均有分布，自古以来作为一种珍贵药用植物使用，由于过度采挖和其生态环境的破坏，野生铁皮石斛数量稀少，野生种濒临灭绝[1]，但目前铁皮石斛市场需求量大，人工栽培是一条有效的解决途徑。由于铁皮石斛在中国分布较广，不同种源地的铁皮石斛的生物学性状、生理特性、糖类含量等方面呈现出差异性，且不同气候环境对铁皮石斛的生长品质有一定影响[2]。铁皮石斛的表型性状也具有较高的遗传多态性，利用茎粗、叶长和叶宽等性状指标进行统计分析，可以为资源筛选和遗传改良提供依据[3]。叶片叶绿素含量是反映铁皮石斛适应性的一项重要生理指标，在一定光强范围内，增大光强有利于提高叶片叶绿素含量，这可能归因于较大光强有助于提升氮素吸收能力[4]；而较大的氮素吸收能力又与良好的根系性状相关[5]。光质的强弱和配比还会影响不同时期铁皮石斛的生长和有效物质的积累[6]。多糖和甘露糖作为铁皮石斛重要的糖类物质，是评价铁皮石斛品质的主要指标[7]，不同叶片形态的铁皮石斛多糖含量存在差异性[8]，但是由于生态环境的差异，如温度、光照和水分等因素对铁皮石斛的影响，导致多糖等糖类含量也会发生改变[9]。

本研究以5个不同种源地的铁皮石斛为试验材料，结合生物学性状、生理指标和糖类成分含量进行测定，研究不同种质铁皮石斛的生长和糖类成分含量高低，以期筛选出适宜在广西南宁地区种植的优良铁皮石斛种源，为下一步筛选优良品种和遗传育种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料采自云南河口、广西桂平、广西玉林、广西乐业、浙江乐清等地的原生种源铁皮石斛，每份样品100株，均为幼苗期引进栽培，分别编号为266、310、311、489、491。在广西农业科学院花卉研究所科研试验大棚引种栽培2 a后，取开花植株进行形态特征、叶绿素、糖类含量测定分析。

试剂：购自上海国药公司，其中无水葡萄糖、苯酚、硫酸、无水乙醇、乙酸铵、盐酸氨基葡萄糖、甘露糖、PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）、氢氧化钠、盐酸、三氯甲烷等均为分析纯，乙腈和甲醇为色谱纯。

仪器：Waters液相色谱仪（美国waters公司），ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美国Agilent公司），水浴锅（江苏金坛中大仪器厂），烘箱（上海一恒仪器公司），高速中药粉碎机（瑞安市百信药机器械厂），低速离心机（伯乐公司），紫外分光光度计（日本岛津公司），索氏提取器（上海洪纪公司），手持式叶绿素仪（日本柯尼卡美能达）。

1.2 方法

1.2.1 形态特征测定 参照刘志高等[10]的方法，稍有改变。每个种源随机抽取样本10株，利用直尺、游标卡尺测量株高、茎尖至下第3节直径、顶叶的长和宽（其相对面积和长宽比分别以长宽积和长宽比表示）等形态指标。

1.2.2 叶绿素含量测定 使用叶绿素仪SPAD-502活体测定铁皮石斛叶片SPAD值。每个品种随机抽取10株样品，于上午9：00～10：00测量，选取茎中部叶片，避开叶脉测定。

1.2.3 多糖和甘露糖含量测定 多糖测定参照《中华人民共和国药典（2010年版）》的方法[11]，每个样品平行提取3次进行测定，每次测定重复3次，取平均值。

甘露糖测定：甘露糖测定参照《中华人民共和国药典（2010年版）》的方法[11]。

色谱条件：ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.02 mol/L乙酸铵缓冲液-乙腈（80：20）。柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长为250 nm，进样量10 μL。

1.3 数据处理

应用SPSS17.0数据处理系统和Excel 2003软件进行试验数据输入、分析和制图。结果采用Duncan法进行品种间差异性比较，pearson法进行相关性分析，分层聚类法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同种源铁皮石斛生物学特性比较

2.1.1 株高 5种不同种源的铁皮石斛经过2 a的引种栽培后，广西乐业种源株高最高，為294.33 mm，云南河口、广西玉林、广西桂平种源分别为258.00、249.33、235.00 mm，浙江乐清品种株高最矮，为231.33 mm；广西乐业、浙江乐清种源与其它种源呈显著性差异；广西玉林种源与云南河口、广西桂平种源之间株高无显著性差异（图1）。

2.1.2 茎粗 云南河口种源茎粗最粗，达到5.96 mm，广西玉林和浙江乐清种源分别为4.65 mm和4.60 mm，广西乐业种源茎粗最细为4.43 mm；云南河口种源与广西桂平、广西乐业、浙江乐清种源之间茎粗呈显著性差异（图2）。

2.1.3 相对叶面积 云南河口种源叶面积最大，为821.89 mm2，广西玉林和广西桂平种源叶面积相似，分别为691.38 mm2和685.01 mm2，浙江乐清种源叶面积最小，为359.49 mm2；云南河口、广西乐业、浙江乐清种源与其它种源叶面积呈显著性差异；广西玉林、广西桂平种源之间叶面积无显著性差异（图3）。

2.1.4 叶绿素SPDA值 叶绿素是吸收光能的主要物质，叶片的吸收量与光线的波长息息相关，通过2种波长范围内的透光系数来确定叶片当前叶绿素的相对数量。广西乐业种源SPAD值含量最高，其平均值为59.17，广西玉林、云南河口和广西桂平种源SPAD值分别为53.43、51.43、49.13，浙江乐清种源SPAD最低，为41.17；浙江乐清种源与其它种源之间SPAD值呈显著性差异；云南河口、广西玉林、广西桂平、广西乐业种源之间SPAD值无显著性差异（图4）。

2.2 多糖含量测定

不同种源的铁皮石斛多糖含量均在25%以上，均符合国家药典要求，其中广西玉林种源铁皮石斛多糖含量最高，为39.5%；其次为广西乐业种源，含量为39%；广西桂平和浙江乐清种源分别为32.6%和31.3%；云南河口种源最低，为25.9%（表1）。

2.3 甘露糖测定

不同种源铁皮石斛甘露糖含量各有不同；广西桂平种源甘露糖含量最高，为25.7%，其次是广西乐业种源，含量为22.8%，广西玉林和浙江乐清种源含量分别为17.7%和16.7%，云南河口种源含量最低，为12.9%（表1）。

2.4 植物学性状与糖类之间相关性

茎粗、叶长等主要农艺性状之间呈显著正相关；株高与多糖、甘露糖等糖类成分呈正相关，茎粗、叶长、叶宽、叶长宽比和糖类成分呈负相关，植物学性状与糖类成分均不呈现显著相关性；多糖与甘露糖2个主要糖类成分呈正相关，但不显著（表2）。

2.5 聚类分析

依据欧氏距离法对5个种源进行分层聚类分析，将5个种源划分成4个类群（图5），类群一为广西玉林和广西桂平种源，此类群植株叶片较大，中等株高，中等茎粗。类群二为云南河口种源，叶面积最大，茎粗最粗。类群三为广西乐业种源，此类群株高最高，叶片中等大小，茎粗最细。类群四为浙江乐清种源，此类群株高较矮，叶片细小，茎粗较粗。

3 讨论与结论

3.1 不同种源铁皮石斛性状分析

在植物学性状比较中，形态学标记是最简单、直观的方法。本研究采用形态学标记，利用差异显著分析与分层聚类分析法相结合，结合前人的研究进展[3]，以7个植物学性状结合糖类指标，可以把5个不同种源的铁皮石斛分为4个类群：云南河口种源茎粗最粗，叶片宽大；广西玉林和广西桂平种源在性状上具有相似性，茎粗中等，叶片较宽大，株高中等；广西乐业种源叶片狭长，叶面积大小中等，株高最高；浙江乐清种源株高最矮，叶面积最小。通过对这5个不同种源地铁皮石斛进行分类能够较好地了解不同类群遗传距离大小，为铁皮石斛杂交选育和优良品系选育提供依据，但是性状测定仅表现植物的表观特性，需要结合多糖等指标进一步筛选。

3.2 不同种源铁皮石斛叶绿素SPAD值

植物的生长发育需要依靠叶绿素对光能的吸收利用，叶绿素光合色素是植物原初光反应过程中的关键因子，其含量的变化往往与叶片的生理活性、植物对环境的适应性有关[12]。铁皮石斛作为兼性景天酸植物，国内对石斛类植物光合特性及光合作用与环境条件的关系研究不多[13]， 而有关不同种源地铁皮石斛叶绿素不同变化未见有报道。沈宗根[14]等对美花石斛、春石斛和铁皮石斛的叶绿素含量进行测定，发现铁皮石斛叶绿素的含量高于其他2种石斛，叶绿素含量的增加保证了叶片在弱光照环境下吸收更多光能用于光合作用。本研究结果表明，广西乐业铁皮石斛种源的叶绿素SPAD值最高，浙江乐清铁皮石斛种源最低，表明广西乐业铁皮石斛在本地具有更好的环境适应性。

3.3 不同种源铁皮石斛糖类成分含量分析

石斛多糖是评价铁皮石斛品质的重要指标，药理研究证明多糖具有增强免疫机能、抗氧化等作用[15]。有研究证明，人工栽培铁皮石斛在生理年龄第二年時采摘最好，多糖含量最高，品质最优[16]。另外，已有学者研究发现不同种源地铁皮石斛多糖含量具有差异性，但对不同种源地多糖含量高低具有争议[17-18]。徐程等[17]对8种不同产地的铁皮石斛多糖含量进行检测，发现浙江富阳种源多糖含量最高，云南种源次之，广西和湖南种源最低。冷春鸿等[18]对温州地区4个不同地区铁皮石斛种源多糖含量进行测定，发现浙江雁荡地区铁皮石斛多糖含量最高，其他依次为福建、广西、云南。本研究结果表明，广西玉林和广西乐业2个种源地的铁皮石斛含量最高，其次为广西桂平种源和浙江乐清种源，云南河口种源最低。经过长时间的驯化，不同的种质对区域气候已产生了相应的响应机制[8]，根据广西的气候、土质等条件下通过调控多糖控制基因的表达量大小引起多糖含量的差异。

甘露糖是单糖类物质，广泛分布于人体组织中，具有调节免疫系统，抑制细菌感染，抑制巨噬炎症细胞等功效[19]。甘露糖含量高低可以作为铁皮石斛的品质评价之一，但对不同生长期含量高低一直存在争议。周桂芬[20]等对不同年份铁皮石斛甘露糖含量进行测定，发现含量高低与年份没有相关性，随着生长年限的增加，铁皮石斛甘露糖含量降低。各产地铁皮石斛甘露糖含量差异可能与铁皮石斛的种质资源、栽培管理、地理环境气候和附生物等有密切相关[21]。戚辉等[22]利用HPLC法测定甘露糖含量，显示广东丹霞地区铁皮石斛的含量最高，云南文山，安徽霍山和浙江温州铁皮石斛的含量依次下降。本研究发现，广西桂平种源其含糖量最高。

铁皮石斛糖类含量随着生长年限提高而提高，在2年龄，糖类含量最高[16]。前期研究显示，广西乐业地区铁皮石斛2年龄的糖类含量比前期测定的6月龄显著增加；而对另外6月龄广东地区铁皮石斛糖类含量测定发现，其糖类含量高于同时期广西乐业地区种源，其在南宁地区适应性可能会好于广西乐业种源，有待日后验证。

本研究结果表明，5个不同种源铁皮石斛均在同一时期种植在同一地点，并且栽培条件完全相同，经过在大棚引种栽培2年后，5种不同种源地的铁皮石斛生物学性状、叶绿素SPAD值和糖类均呈现出差异性。铁皮石斛的引种栽培，应充分考虑生态环境气候的影响，结合农艺性状和糖类含量为参考。本研究结果发现，广西桂平和广西乐业2个种源在南宁地区的适应性较好，适宜推广种植。

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