青海芥菜型油菜多室基因Bjln2的初步定位

陈翠萍等

摘要：多室油菜具有多室多粒的特征，是提高油菜产量的一个有效途径。利用青海芥菜型多室油菜的BC4分离群体对油菜多室基因Bjln2进行初步定位，对分离群体的性状分离比进行卡方检测，检测结果符合1 ∶1，表明多室性状遗传稳定。利用扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）与分群分析法（bulk segregate analysis，BSA） 相结合的方法共筛选获得3个与目标基因紧密连锁的标记。连锁遗传分析的结果表明，3个AFLP标记均位于基因Bjln2的同侧，其中SA03MC16距Bjln2基因最近，遗传距离约为13.1 cM；SA14MC13距Bjln2基因最远，遗传距离约为23.5 cM；图谱总长23.5 cM，标记间平均图距为7.8 cM。研究结果为多室基因的精细定位及图位克隆奠定了基础。

关键词：青海省；芥菜型油菜；多室；基因定位；扩增片段长度多态性；分群分析法

中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0032-03

收稿日期：2015-03-19

基金项目：国家“863”计划（编号：2011AA10A104）；青海省重点实验室发展专项（编号：2014-Z-Y11）。

作者简介：陈翠萍（1989—），女，陕西渭南人，硕士研究生，研究方向为春油菜分子生物学。E-mail：chencuiyang@126.com。油菜是世界4大油料作物之一，在世界油料作物中占有重要地位。一般来说，油菜的成熟角果内有膜状隔膜（或称假隔膜），将每个角果分为2室，外被2片壳状果瓣；多室油菜的角果被假隔膜分为3～4室，外被3～4片壳状果瓣。油菜的多室性状在目前种植的3大类型油菜中均有发现：在芥菜型油菜中，有山西省的三筒油菜、贵州省的四轮油菜、青海省的多室油菜、四川省的四棱油菜；白菜型油菜中有印度沙逊油菜、西藏的桑日白油菜等；甘蓝型油菜中有三棱角油菜、人工创造的甘蓝型多室油菜[1-3]。赵洪朝等发现，多室油菜的单株产量显著高于相同遗传背景下2室油菜的单株产量，主要原因是多室油菜角粒数多[4-6]。

吕泽文等对芥菜型多室和2室角果、子房石蜡切片观察发现，多室角果由4心皮发育而来，4个果瓣包围种子，2个假隔膜平行，将角果分隔成3个腔室，中间的腔室大于两侧的腔室[5]。有学者对白菜型多室油菜的雌蕊子房横切切片观察发现，多室油菜的子房有12～16个心皮维管束，子房在发育过程中心皮连成1个圆环，之后房室开始分化，胚珠、假隔膜同时发生。朱彦涛对甘蓝型多室研究发现，多室角果横切面呈3室，隔膜横截面呈“Y”形[7]。

Varshney对印度沙逊油菜进行研究发现，角果果室性状受1对基因控制，且2室对多室表现完全显性[8]。何余堂等研究表明，白菜型油菜的多室性状受1对隐性基因控制[9]。Choudhary对印度芥菜型多室油菜研究发现，2室为显性性状，4室为隐性性状，多室性状受2对隐性基因控制[10-11]。赵洪朝等对芥菜型多室性状的遗传规律进行研究发现，多室性状的遗传受1对主效基因控制，且被微效基因所修饰，无胞质效应[12]。吕泽文利用甘肃芥菜型多室油菜为材料，证实多室性状受2对独立遗传的隐性核基因控制，且多室性状无细胞质效应，遗传稳定，将这2对多室基因分别命名为mc1、mc2[13]。初步定位的结果表明，mc1基因位于A基因组上。Xiao等对青海芥菜型多室油菜遗传分析表明，多室性状受2个独立遗传的基因控制，且多室为隐性性状，无胞质效应，分别定义为Bjln1、Bjln2[14]。

获得与多室性状紧密连锁的分子标记为多室性状基因定位及克隆奠定基础，同时也有利于利用分子标记对多室性状进行快速而准确的跟踪，从而加速多室油菜的选育进程[15-16]。Xu等利用扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）分子标记对Mc1进行精细定位，筛选到目标基因Mc1两侧最近的连锁标记EC14MC14、SC20，分别距离Mc1 1.1、1.6cM，将Mc1定位于A基因组第7染色体上，构建了Mc1的连锁图谱[17]。Xiao等通过AFLP和SSR分子标记，筛选到与Bjln1紧密连锁的2个AFLP标记和7个SSR标记，将多室基因Bjln1进行基因定位，将控制多室的Bjln1基因定位到A7连锁群的约208 kb左右的区域内[14]。

Fan等利用多室突变体m14和二室野生型白菜型油菜为材料，通过对CLV3类似物的分离和功能特性的研究认为，单核苷酸替代（T-C）后的新型BrCLV3是控制顶端分生组织大小、腔室和角果粒数多少的主要原因[18]。表达分析表明，反馈回路中涉及到CLV3、WUS的假定的负调控途径在m14突变体中被中断。

番茄中也有多室性状的研究。Muos等对番茄多室性状研究时发现，番茄的多室性状主要受2对QTL控制，分别为fas、lc 2对基因相互影响[19]。lc QTL包括1 600 bp碱基，距WUSCHEL 3′末端1 080 bp碱基，通过编码蛋白质调控茎细胞。lc的分子进化显示，2个单核苷酸多态性的异常导致遗传多样性降低，2个单碱基的突变导致了果室数目的增加。并认为果室数目的进化模型是fas突变出现在lc突变之后从而导致极端多室的形成，使番茄产量提高数倍。

本研究所用材料为青海芥菜型多室油菜，除具有多室性状外，还具有黄籽、抗裂角等优良性状，是一种优异的种质资源[4，20]。遗传分析结果表明，青海芥菜型油菜多室性状受2个独立遗传的基因位点控制，即Bjln1、Bjln2，多室对2室为隐性，无胞质效应[14]。本研究在前人研究的基础上，以青海芥菜型油菜多室回交分离群体BC4为材料，利用AFLP标记[21]结合分群分析法（bulk segregate analysis，BSA）[22]，初步寻找与芥菜型油菜多室基因Bjln2紧密连锁的分子标记，建立芥菜型油菜角果多室基因Bjln2位点所在区域的遗传连锁图谱，为该基因的精细定位和克隆奠定基础。同时，紧密连锁的分子标记可将果室性状的鉴定提早到苗期进行，从而加快育种进程，提高育种效率[23]。

1材料与方法

1.1材料与群体构建

本试验所用亲本为青海芥菜型多室油菜和新芥（2室），青海芥菜型多室油菜是源于青藏高原的一种地方品种，有3～4个心皮。材料均由青海省农林科学院春油菜研究所提供，经过自交7代以上，多室性状可以稳定遗传。青海芥菜型多室油菜与新芥杂交，获得F1代，F1代自交获得F2代，F2代与亲本多室油菜连续回交4代，得到包含1 754株的BC4分离群体，并随机挑选198株单株作为试验用的作图分离群体。

1.2DNA 的提取及样品池的构建

在油菜苗期，对田间单株进行编号。植株长至4～5张真叶时，每个单株取2～3 cm2的新鲜叶片，用CTAB小样法提取叶片总 DNA，具体方法参考Doyle等的方法[24]并略作改动。DNA浓度及质量用紫外分光光度计检测（Eppendorf Spectrophotometer，Biophotometer），再用TE缓冲液稀释至50 ng/μL，于-20 ℃保存备用。

在油菜角果成熟期，对田间单株进行性状调查。油菜2室与多室性状鉴定采用肉眼鉴定的方法。单株多室角果率>95%记为多室株，没有多室角果的单株记为2室株。根据田间调查结果，在BC4群体中随机选择12个多室单株和12个2室单株，每6个单株的DNA等量混合，分别构建2个多室基因池和2个2室基因池，用于BSA分析。

1.3AFLP分析

AFLP分析参考陆光远提到的Vos等的方法[25]并略作改动。采用的酶切组合为SacⅠ/MseⅠ，预扩增采用的引物组合为 SA/MC，预扩产物稀释30倍后作为选择性扩增的模板。将等体积的选择性扩增产物和Loading Buffer （98%甲酰胺，0.025%二甲苯蓝，0.025%溴酚蓝，10 mmol/L EDTA，pH值8.0）混合，然后用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，硝酸银染色观察结果。

利用已构建好的多室基因池、2室基因池进行引物筛选。有特异性的引物再在BC4群体中随机挑选6株2室株、6株多室株进行验证。

1.4连锁分析

利用得到的AFLP标记对BC4分离群体中随机挑选的198株单株进行检测，结合田间性状调查结果，筛选交换单株，计算重组率。利用JoinMap 4.0 软件构建遗传图谱，先用New project创建1个新的文件夹，用Load data 导入标记数据，再用Kosambi函数[26]将重组率转换为遗传距离，最后用Map Draw 构建连锁图谱。

2结果与分析

2.1BC4分离群体果室性状表现

青海芥菜型多室油菜和新芥（2室）连续回交4代获得的BC4分离群体有效单株共1 754株，其中多室单株882株，2室单株872株。经卡方检测，结果符合1 ∶1（χ2=0.057）（表1）。

2.2与Bjln2基因连锁的AFLP标记

利用已构建的多室基因池、2室基因池进行AFLP标记的筛选，将筛选得到的标记在BC4分离群体的单株中进行验证，最终确定3个AFLP标记与Bjln2基因紧密连锁。3个AFLP标记用于扫描BC4群体中的198个单株 （图1）。

2.3遗传连锁图谱的构建

将BC4群体中198个单株的性状和3个与Bjln2基因紧密连锁的AFLP性标记数据导入JoinMap 4. 0软件，分析3个标记与Bjln2基因的相对位置及距离。结果表明，这3个标记均位于Bjln2的同侧，其中SA03MC16距Bjln2基因最近，遗传距离约为13.1 cM；SA14MC13距Bjln2基因最远，遗传距离约为23.5 cM；图谱总长23.5 cM，标记间平均图距为7.8 cM（图2）。

3结论与讨论

目前，多室性状在油菜3大栽培种（甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜）中均有发现。多项研究表明，多室油菜的单株产量显著高于其对应的二室油菜的单株产量，主要原因是多室油菜角粒数较多，因此油菜多室性状对油菜产量的提高具有重要意义[4-6]。前人对青海芥菜型多室油菜的遗传规律和基因定位进行了探究，证实其多室性状是受2对独立遗传的基因控制，无胞质效应，并分别命名2对基因为Bjln1、Bjln2。同时进一步对Bjln1进行基因定位，将Bjln1基因定位到A7连锁群的约208 kb左右的区域内[14]。

本研究对因Bjln2基因进行初步定位。对BC4分离群体性状分离卡方检测后符合1 ∶1，证明多室性状遗传规律的稳定性，为多室基因Bjln2的定位奠定基础。利用256对AFLP引物进行引物筛选，共获得3个与目标基因连锁的AFLP标记，均位于Bjln2基因的同侧，其中SA03MC16距Bjln2基因最近，遗传距离约为13.1cM；SA14MC13距Bjln2基因最远，遗传距离约为23.5cM；图谱总长23.5 cM，标记间平均间距为7.8 cM。Xu等将Mc1定位到A基因组7号染色体上，两侧最近的标记距离分别为1.1、1.6cM，构建了Mc1的连锁图谱[17]。黄籽沙逊既有2室又有3室材料，Yadava等利用F2、F6、F7群体进行QTL定位，发现控制多室位点的基因位于A4连锁群，同时利用单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism，SNP）将其定位到Bra034340，与拟南芥中的CLAVATA3同源，并将此作为候选基因[27]。这与Fan等的研究结果[18]类似。由于本研究还未将Bjln2基因定位到染色体上，因此Bjln2基因是否与Fan等或Xu等报道的是同一个位点还不可知。

本研究所得的4个AFLP标记均位于Bjln2一侧，且分布较为分散，这可能与所选的酶切组合有关，且本研究所选酶切组合较少，缺少有关EcoRⅠ/MseⅠ、PstⅠ/MseⅠ的酶切组合，所以没能筛选到足够多的AFLP标记，因此要尽量筛选出更多的与Bjln2紧密连锁的分子标记。随着与Bjln2连锁的分子标记的增加，遗传图谱的精度会不断提高，有利于多室基因的图位克隆。甘蓝型油菜是目前种植面积最大的栽培种，克隆获得的多室基因可通过转基因技术导入甘蓝型油菜，从而加快甘蓝型油菜的育种进程，提高油菜产量[28-37]。

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