基因的生物信息学分析

高南等

摘要：Shaker类型K+通道在植物钾的吸收、转运及其他生理过程中发挥着重要作用。AKT2/3是Shaker类型K+通道中唯一既主导K+内流，又允许去极化情况下K+渗漏性外流的通道。水稻OsAKT2/3蛋白的生物信息学分析表明，OsAKT2/3蛋白含有K+通道的标志性序列TxxTxGYGD；该基因分子式为C4219H6693N1179O1233S35，理论等电点为664，氨基酸残基组成中亮氨酸残基含量最高；有一定的亲水性，为跨膜蛋白；可能存在31个翻译后修饰位点、5种结构域、52个磷酸化位点，不含信号肽；序列主要构件为α-螺旋和折叠延伸；该蛋白与其他植物的AKT2/3家族成员具有较高的同源性。试验结果为OsAKT2/3基因生理功能的深入研究提供一定依据。

关键词：水稻；二级结构；磷酸化位点；三级结构；系统进化

中图分类号：Q785；Q945.12 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0025-03

钾是植物必需的大量元素，对提高作物产量、改善产品品质起着重要作用。水稻（Oryza sativa L.）对钾素的需求量较大，不同基因型的水稻对土壤中钾素的吸收利用存在很大差异[1]。缺钾可影响细胞渗透压平衡，进而引起器官机能的破坏，影响植物的正常生长；并通过植物激素调节破坏植物体内的代谢和转运过程，导致作物的产量和品质大幅下降[2]。我国大部分耕地土壤供钾不足，其中严重缺钾土壤（速效钾<50 mg/kg）约2 000万hm2，占耕地面积的20%以上，且主要分布于我国的水稻产区；因此，需施用钾素化肥以保证水稻的丰产和品质，而我国钾矿资源十分匮乏，95%以上的钾肥供应依赖进口[3]。K+通道在植物体内的表达能改良植物的钾素营养性状[4-5]；因此，挖掘植物中钾吸收利用的基因并研究其生理功能，对水稻钾营养性状的改良及现有钾素资源的利用具有重要意义。Shaker类型K+通道在植物钾的吸收、转运及其他生理过程中发挥着重要作用[2，6-7]。AKT2/3是Shaker类型K+通道中唯一既主导K+内流、又允许去极化情况下K+渗漏性外流的通道，其电生理特征表现为弱内向整流、能够感应K+水平、受Ca2+和H+调控[8-9]。其独有的渗漏型电流，在过量K+迅速吸收进入细胞而导致的膜电位去极化情况下，通过胞内K+的渗漏从而实现对膜电位的精确微调作用[10]。目前，水稻的基因组测序已经完成，但关于水稻K+通道的研究尚较少[11-13]。本研究利用生物信息学的方法对水稻OsAKT2/3蛋白的理化性质、核苷酸序列组成、跨膜结构、亲水性、疏水性、亚细胞定位进行分析，并对其结构域、磷酸化位点、二级结构、三级结构进行预测，最后进行系统进化分析，以全面了解OsAKT2/3基因，为该基因生理功能的深入研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料

NCBI中GenBank数据库已注册水稻OsAKT2/3基因（JN989970.1）、拟南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.]的AKT2/3（NP_567651.1）、大麦（Hordeum vulgare L.）的HvAKT2（ABE99811.1）、雨树[Samanea saman （Jacq.）Merr.]的SPICK1（AAD16278.1）和SPICK2（AAD39492.1）、欧美杨（Populus tremula L.×Populus tremuloides Michx.）的PTK2（CAC05489.1）、玉米（Zea mays L.）的ZMK2（NP_001105120.1）。1.2方法

OsAKT2/3蛋白的理化性质使用ProtParam软件在线分析；蛋白跨膜结构使用TMHMM软件在线分析；亲水性及疏水性使用ProtScale软件在线分析；蛋白亚细胞定位使用TargetP软件、WoLF PSORT软件在线分析；蛋白序列上潜在的结构域和功能位点使用MotifScan软件、CCD软件预测；蛋白磷酸化位点使用NetPhos软件在线分析；蛋白信号序列使用SignalP4.1软件在线分析；蛋白二级结构使用SOPMA软件在线分析；蛋白三级结构使用Phyre2软件在线分析；利用MEGA 6.05软件，采用Neighbor-Joining法构建系统进化树。上述各分析软件的网址见表1。

2结果与分析

2.1OsAKT2/3蛋白的理化性质分析

由序列分析结果可知，OsAKT2/3蛋白含有K+通道的标志性序列TxxTxGYGD。用ProtParam软件分析得知，OsAKT2/3 蛋白共有13 359个原子，分子量为94 783.8，蛋白的分子式为C4219H6693N1179O1233S35，理论等电点为6.64。在855个氨基酸残基组成中，OsAKT2/3蛋白的N端为蛋氨酸，含量较高的氨基酸残基包括亮氨酸残基（10.2%）、缬氨酸残基（8.5%）、甘氨酸残基（7.3%）、精氨酸残基（7.1%）、丝氨酸残基（7.1%）；含量较低的氨基酸残基包括色氨酸残基（1.1%）、半胱氨酸残基（1.4%）等。带负电荷的氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）残基为99个；带正电荷的氨基酸（精氨酸、赖氨酸）残基为95个。OsAKT2/3蛋白在哺乳动物、酵母、大肠杆菌中的半衰期分别为30 h（体外）、>20 h（体内）、>10 h（体内），不稳定指数为39.03，该蛋白为稳定蛋白。

2.2OsAKT2/3蛋白的亲水性、疏水性、亚细胞定位

使用ProtScale软件预测OsAKT2/3蛋白的亲水性及疏水性可知，氨基酸的最低分值为-2.967，最高分值为3.133（图1）。整体来看，亲水性氨基酸残基分布于整条肽链，且多于疏水性氨基酸残基。使用TMHMM软件进行预测，将参数设置为默认值，可知OsAKT2/3蛋白为跨膜蛋白。WolfPsort软件预测该蛋白可能在细胞质膜上，TargetP软件预测该蛋白在叶绿体膜上的可能性为79.6%。

2.3OsAKT2/3蛋白结构域、功能位点的预测

OsAKT2/3蛋白序列上潜在的结构域、功能位点使用MotifScan软件、CCD软件进行预测。结果表明，该蛋白可能存在的翻译后修饰位点包括1个酰胺化位点、4个N-糖基化位点、1个cAMP磷酸化位点、11个酪蛋白激酶Ⅱ位点、7个酰化位点、7个蛋白激酶磷酸化位点；发现5种结构域，分别为锚蛋白重复（ANK，cd00204）、环核苷酸结合结构域（CAP_ED，cd00038）、未知功能的DUF3354超级家族结构域（DUF3354，pfam11834）、离子转运结构域（Ion_trans_2，pfam07885）、电压依赖的钾离子通道结构域（PLN03192，PLN03192）（图2）。该蛋白具有Shaker基因家族的典型特征，即蛋白的N末端包括6个跨膜区（S1～S6），有电压感受区和高度保守的通道孔区。使用磷酸化位点预测程序NetPhos 2.0发现OsAKT2/3蛋白有37个潜在的丝氨酸磷酸化位点、7个潜在的苏氨酸磷酸化位点、8个潜在的酪氨酸磷酸化位点。使用SignalP 4.1 Server软件在线分析OsAKT2/3蛋白的信号肽情况，结果显示该蛋白不含信号肽序列。

2.4OsAKT2/3蛋白二级结构、三级结构的分析

使用SOPMA软件预测OsAKT2/3蛋白的二级结构，结果显示OsAKT2/3蛋白由43.16%的α-螺旋、17.19%的折叠延伸、8.30%的β-转角、31.35%的无规则卷曲构成，其中折叠延伸和β-转角不均匀分布于整个蛋白质的多肽链上。依据模板c2ptmA，采用折叠识别法，使用Phyer2软件在线预测OsAKT2/3蛋白序列主链原子位置，生成预测蛋白三级结构模型（图3），并依据能量最小化原理使侧链集团处于能量最小的位置。该蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，与蛋白质二级结构分析结果相似。

2.5OsAKT2/3编码基因的系统进化分析

在NCBI上共选取6种植物的7个AKT2/3基因序列，以拟南芥KAT1基因作为外群，构建系统进化树。结果显示，水稻OsAKT2/3在进化上与单子叶植物玉米的ZMK2、单子叶植物大麦的HvAKT2的亲缘关系较近，与双子叶植物拟南芥的AKT2/3等有较高的相似度（图4）。

3结论与讨论

蛋白质的功能不仅取决于其一级结构，在很大程度上也取决于其高级结构。生物信息学综合运用数学、计算机技术、生物学的各种工具，较好地阐明和理解大量数据所包含的生物学意义。基因序列及其特性分析、蛋白质空间结构模拟等是生物信息学的重要组成部分。利用生物信息学的原理，通过计算机模拟相关的辅助信息，可在较短时间内，用较低成本获得大量可靠的蛋白质结构和功能信息[14-15]。本研究通过网络资源，在前期获得水稻OsAKT2/3的基础上，应 用ProtParam、TMHMM等分析软件，对OsAKT2/3蛋白的亚细胞定位、结构域、磷酸化位点、二级结构等蛋白特性进行预测，并对其三级结构进行初步分析模拟，以期尽可能多地获得该蛋白质结构及功能的信息，为OsAKT2/3基因功能的研究提供更多、更可靠的理论依据。

Shaker类型K+通道在植物钾的吸收、转运及其他生理过程中发挥着重要作用[2，6，11]。OsAKT2/3蛋白含有K+通道的标志性序列TxxTxGYGD；该基因分子式为C4219H6693N1179O1233S35，理论等电点为6.64，氨基酸残基组成中亮氨酸残基含量最高；有一定的亲水性，为跨膜蛋白；可能存在31个翻译后修饰位点、5种结构域、52个磷酸化位点，不含信号肽；序列主要构件为α-螺旋和折叠延伸；该蛋白与其他植物的AKT2/3家族成员具有较高的同源性。本试验结果为OsAKT2/3基因生理功能的深入研究提供一定依据。然而，同源性仅是基因序列和蛋白结构上的类似，虽然某些典型功能相近，但来源不同的同源通道常表现出独特之处。在氨基酸序列、关键结构元件上，玉米的ZmK2.1 K+通道与拟南芥的KAT1通道均高度同源，但其功能特征却存在显著差异[16]。与其他AKT2/3型K+通道相比，OsAKT2/3的功能特征是否存在独特之处仍需进一步研究。

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