低温处理下白玉菇丝氨酸蛋白酶的活性及分子特征

孙新菊等

摘要：白玉菇（Hypsizygus marmoreus）是真姬菇的白色品种，其营养价值丰富，具有独特的蟹香味。为延长白玉菇的货架期，对其进行低温处理，并研究在贮藏过程中丝氨酸蛋白酶活性及分子特征的变化。研究结果显示，白玉菇在低温（4 ℃）处理下可保鲜5 d，而在常温（25～28 ℃）下保鲜时间则很短（1～2 d）；对白玉菇贮藏过程中丝氨酸蛋白酶的活性及Spr基因表达的研究表明：低温处理下丝氨酸蛋白酶的活性及基因的表达都明显低于对照。研究结果说明，白玉菇的货架期与丝氨酸蛋白酶活性密切相关。

关键词：白玉菇；低温处理；丝氨酸蛋白酶；Spr基因表达；分子特征

中图分类号： S646.909+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0270-03

白玉菇味比平菇鲜，肉比滑菇厚，质比香菇韧，口感极佳，还具有独特的蟹香味。白玉菇的蛋白质中氨基酸种类齐全，包括8种人体必需氨基酸，其菇体洁白如玉，质地细腻，是一种低热量、低脂肪的保健食品[1]。

在食用菌贮藏过程中，会受到温度、水分、采收时期、气体环境、病原菌感染及有氧呼吸等的影响而出现失重、菌柄生长、菌伞开张、菌褶发育、菌盖伸展、孢子形成与弹射、纤维素化、组织呈水浸状、褐变以及品质下降等现象[2]，这些症状的产生与食用菌的生理代谢及其分子机理密切相关。食用菌储藏过程中，蛋白质的降解会引起细胞结构及生理功能的变化，还会引起氨基酸含量的升高，正是氨基酸含量及组成的变化造成了食用菌风味的变化[3]。丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要蛋白水解酶，广泛分布于植物中，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用[4-5]。目前已经从芫荽、欧芹、双孢菇等植物中分离到了不同类型的丝氨酸蛋白酶，其活性随着植物生长发育阶段的不同而变化。Azeez等研究发现，在唐菖蒲的衰老过程中丝氨酸蛋白酶的活性不断提高[6]；Roberts等采用蛋白酶单一抑制剂的检测方法在衰老的大麦叶片中和暗诱导衰老的大麦叶片中发现2种丝氨酸蛋白酶[7]。多种植物的衰老过程都与丝氨酸蛋白酶活性的不断提高相关，如大麦、鸢尾、欧芹、月季、木樨和双孢菇等[4-11]。

为延长白玉菇的货架期，本研究对其进行低温处理，并研究在贮藏过程中丝氨酸蛋白酶活性及分子特征的变化。通过对白玉菇丝氨酸蛋白酶活性的测定及Spr基因表达的研究，不仅有助于揭示白玉菇采后品质变化的分子机制，并可为调控白玉菇采后保鲜提供新途径。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料来自当地超市刚刚上架的白玉菇，并在1 h内拿到实验室，选择没有机械损伤、疾病以及形状、颜色均匀的作为试验材料（图1-a）。试验材料分为2组，每组10个，一组放在4 ℃冰箱，另一组常温放置（25～28 ℃）；分别放置 5 d，每组3次重复。每组的3个重复每天分别取样（菌柄、菌盖、菌褶）后立即用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.2试验方法

1.2.1丝氨酸蛋白酶活性的测定白玉菇丝氨酸蛋白酶活性的测定具体步骤参照丝氨酸蛋白酶（PRSS）ELISA试剂盒说明。

1.2.2基因组DNA提取采用改良的CTAB-氯仿-异戊醇法进行白玉菇基因组DNA提取[12]。

1.2.3总RNA的提取及cDNA的合成本试验提取RNA所用的离心管、枪头等塑料用品先用0.1%的DEPC水浸泡12 h，再高压蒸汽灭菌20 min（120～126 ℃），烘干。研钵、研棒用三氯甲烷浸泡2 h，用干净手套装好并放入80 ℃烘箱中2 h，烘干。具体步骤参照BioFlux RNA提取试剂盒说明。

取1 μL RNA，加入2 μL溴酚蓝，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果出现28S、18S 2条带，说明RNA完整，5S带有时也会出现。28S带的浓度是18S带的2倍，说明RNA质量很好（图2）。第1链cDNA合成的具体步骤参照TaKaRa提取试剂盒说明。

1.2.4实时荧光定量PCR（qRT-PCR）用DNASTAR软件设计特异引物ActinF、ActinR、SprF、SprR（表1）。PCR反应体系（25 μL）参照TaKaRa RT-PCR反应体系说明书。在Bio-Rad荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR，PCR反应程

序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。每个样品3次重复，Actin基因为表达分析内标参照，使用2-ΔΔCT法计算待测基因相对表达量，用Excel 2003整理试验数据并作图。

表1特异引物名称及信息

引物碱基序列（5′→3′）ActinFTACTCCGTCTGGATTGGTGActinRGACTCGTCGTATTCTTGCTTSprFGCAAGCGCAGATGGAAATGGACASprRCTGGCGCCGACCGTGATGACT

2结果与分析

2.1白玉菇货架期

白玉菇在低温（4 ℃）处理下可保鲜5 d；在常温（25～28 ℃）下保鲜时间则很短，为1～2 d（图1-c），之后出现菌伞开张、组织失水、褐变及营养物质流失等现象。

2.2丝氨酸蛋白酶的活性

由图3可知，白玉菇在常温贮藏过程中，丝氨酸蛋白酶的活性与贮藏0 d相比，一直处于上升趋势并在贮藏4 d升到最高，之后又下降；在低温贮藏过程中，丝氨酸蛋白酶的活性一直处于下降趋势，直到在贮藏5 d时降到最低点。另外，在整个贮藏过程中，常温处理下白玉菇丝氨酸蛋白酶的活性明显高于低温处理，可见低温处理可以抑制丝氨酸蛋白酶的活性。

2.3丝氨酸蛋白酶基因的表达

应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明，丝氨酸蛋白酶基因在贮藏0 d的白玉菇菌柄中的表达量最大，其次是菌盖，菌褶中的表达量最低（图4）。丝氨酸蛋白酶基因在常温贮藏5 d的白玉菇菌柄中的表达量最大，在菌盖、菌褶中的表达量很低；在低温贮藏5 d的白玉菇菌柄中有少量表达，在菌盖、菌褶中不表达（图5）。丝氨酸蛋白酶基因在常温贮藏的白玉菇菌柄中的表达一直处于上升趋势并在贮藏4 d时升到最高，之后又下降；而在低温贮藏的白玉菇菌柄中一直处于下降趋势；丝氨酸蛋白酶基因在常温贮藏的白玉菇菌柄中的表达量明显高于低温贮藏的（图6）。总体看出，低温处理下，丝氨酸蛋白酶基因的表达受到抑制，这个结果与丝氨酸蛋白酶的活性变化相一致。

3讨论

由于食用菌贮藏过程中极易变质，薄膜气调包装[13]、化学处理方法[14]、辐照处理[15]、温度处理及CO2气调处理[16]等采后处理技术已被广泛用于各种食用菌，以解决其采后腐烂、货架期短及品质劣变的问题。蛋白酶在植物细胞程序性死亡（PCD）及衰老过程中均起重要作用[17-19]，白玉菇采收后，蛋白质会因为蛋白酶或肽酶的作用分解成氨基酸而降解，在一定程度上导致菇体衰老、品质及商品性急剧下降，因此研究白玉菇采后安全、有效的保鲜技术显得尤为重要。

丝氨酸蛋白酶广泛分布于植物中，多种植物的衰老过程都与其活性的不断提高相关联[4-10]。丝氨酸蛋白酶不仅作用于蛋白质的降解，还常常作为一种信号涉及细胞程序性死亡（PCD）或调控细胞自噬[6，20-23]。在贮藏0、1 d的双孢菇菌柄中，丝氨酸蛋白酶的活性比较低；而从贮藏2 d开始，其活性快速升高直到贮藏4 d，到贮藏5 d又下降[10]。在本研究中，白玉菇在常温贮藏过程中，丝氨酸蛋白酶活性的变化与Burton等研究双孢菇的结论[10]基本一致；本研究讨论在低温贮藏过程中，丝氨酸蛋白酶的活性一直处于下降趋势，并且在整个贮藏过程中，低温处理下白玉菇丝氨酸蛋白酶的活性明显低于常温处理，低温能够抑制丝氨酸蛋白酶的活性，从而延长货架期。

Kingsnorth等研究发现，丝氨酸蛋白酶基因在刚采收的双孢菇中不表达，而在采后贮藏1 d的双孢菇中开始表达，并在第3天达到最大值，之后又下降；Kingsnorth等还对双孢菇不同组织中丝氨酸蛋白酶基因的表达进行研究，发现在贮藏2 d的双孢菇菌柄中的表达量最大[24]。Heneghan等应用绿色荧光蛋白和双孢菇Spr1基因启动子技术对该基因在双孢菇中的表达进行了研究，发现在双孢菇子实体中，Spr1基因活动定位于采后衰老的子实体菌柄中[11]。本研究中，在白玉菇3个不同部位（菌柄、菌盖、菌褶），丝氨酸蛋白酶基因在菌柄中的表达量最大；与低温处理相比较，丝氨酸蛋白酶在常温贮藏4 d的白玉菇菌柄中的表达量最大，这些结果与Heneghan等的研究结果[11，24]基本一致。从本研究结果可以看出，低温处理下，丝氨酸蛋白酶的活性和基因的表达均受到抑制，表明丝氨酸蛋白酶的高活性及高表达量在一定程度上导致白玉菇的衰老、品质及商品性急剧下降。本研究有助于阐明白玉菇衰老的分子机制，并可为调控白玉菇采后保鲜以及延长货架期提供重要的理论与实践意义。

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