电生功能水抑制微生物及其产生毒素研究进展

贾国梁，石晶盈，李法德，*

（1.山东农业大学机械与电子工程学院，山东 泰安 271018；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰 安 271018）

电生功能水抑制微生物及其产生毒素研究进展

贾国梁1，石晶盈2，李法德1，*

（1.山东农业大学机械与电子工程学院，山东 泰安 271018；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰 安 271018）

由于电生功能水具有广谱杀菌性、效率高、经济、安全、环保等诸多优点，近几年，在抑制或杀灭微生物活性方面受到了人们的普遍关注。目前，强酸性电生功能水的应用已较广泛，也有一些微酸性及中性电 生功能水应用于农业、 食品领域的报道。随着研究的不断深入，电生功能水与其他多种处理手段的结合，电生功能水杀 菌成分与机理，电生功能水的杀菌条件等问题也 被不断探究。本文论述电生功能水杀菌、灭活病毒、毒素等方面的最新研究进展，指出目前研究中存在的问题以及今后的发展方向。

电生功能水；微生物；农业；食品；杀菌剂

电生功能水（electrolyzed function water），也称为电解氧化电位水（electrolyzed oxidizing water，EOW），最早发源于日本［1］，是指将添加少量含氯电解质的水置于一种特殊装置中，经电场处理，使水的pH值、氧化还原电位（oxidation-reduction potential，ORP）、有效氯含量（avail able chlorine content，ACC）等指标发 生改变而产生的具有特殊功能的电解水。日本在2002年已将EOW作为一种食品添加剂［2］。EOW包括酸性电生功能水（acid electrolyzed water，AEW）、碱性电生功能水（alkaline electrolyzed water，AlEW）和中性电解水（neutral electrolyzed water，NEW）。本文主要涉及具有抑菌及杀菌作用的AEW和NEW。AEW按照pH值不同可分为强酸性电生功能水（strongly acid electrolyzed water，StAEW，2.3＜pH＜2.8）和微酸性电生功能水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW，5.5＜pH＜6.5）［3］。NEW的pH值范围大约都在6.5～8.5内，氧化还原电位大约都在800～1 000 mV内［4-6］。EOW具有安全、经济［7-10］、容易操作、副作用少［11］等优点。本文对近几年来在农业和食品领域电生功能水在微生物抑制等方面的研究进展进行论述，主要包括电生功能水的制备和应用、杀菌条件的优化、杀菌机理及存在的问题与发展方向等。

1　EOWW的生成

根据工作方式的不同，可将EOW生成装置分为间歇式和连续式两大类。而按照电解室结构的不同，可将EOW生成装置分为隔膜式和无隔膜式（图1）。本实验室针对已有技 术的特点，发明了浸没式电解混合装置［12］。该设备采用浸没式结构，有效地避免了电解室在工作过程中的温度升高，既减小了设备体积，又可以避免酸性电解液和电解过程中产生的氯气泄露，减少了对环境的污染，提高了设备的安全性；并可通过调节电压、电流、电解液与原水流量等操作参数生产出具有不同指标（pH值、ORP、ACC）的EOW。NEW的生成类似于AEW，但是阳极形成的部分产品又重新回到阴极区，因此增加了ClO-的量［13］。

图1　无隔膜式（A）和隔膜式（B）电解槽Fig.1 Electrolytic cells without （A） or with （B） a membrane

2　EOW在抑制真菌、细菌、病毒和毒素领域的应用

2.1EOW用于控制植物病害

植物病害会使植物的机能被破坏或干扰。化学防治是目前控制植物病害最常用、效果最好的方法，但化学防治常常导致农药残留、环境污染、病原菌抗药性增强，也不利于施药人员的自身安全。EOW在控制植物病害方面的优势较为明显。一些学者已证明了EOW对Penicillium digitatum、Aspergillus flavus、Sphaeroteca spp.、Botrytis cinerea和Oomycete phytophthora的功效［14-17］。利用EOW控制小麦条锈病［18］、葡萄炭疽病［19］和黄瓜白粉病［20］等也取得了良好的效果，在条锈菌潜育期1 周喷洒2 次AEW（理化指标：pH （2.5±0.1）、ORP（1 150±20） mV、ACC（70±20） mg/L）对小麦条锈病的防治效果为100%，与粉锈宁农药防治效果接近［18］；对未发病的葡萄植株进行病害防治实验，发现AEW（理化指标：pH（2.5±0.1）、ORP（1 150±20）mV、ACC（70±20）mg/L）对葡萄炭疽病的防治效果（32.24%～44.04%）优于农药百菌清，且不会给葡萄植株造成损伤［19］；对已经发病的黄瓜进行叶面喷洒，发现AEW（理化指标：pH（2.5±0.1）、ORP（1 150±20）mV、ACC（100±5）mg/L）处理后，黄瓜叶面的白粉病防治效果达到70%以上［20］。

据不完全统计，国内烟草受烟草黑胫病菌影响，每年产量损失高达2.869 26×107kg，产值损失超1.23 亿元［21］。为了抑制烟草黑胫病的发生，Hou Yatao等［22］利用电生功能水对Phytophthora parasitica var. nicotianae的体外生长进行抑制实验，研究了电生功能水处理时间间隔、有效氯含量、pH值和浸没时间对Phytophthora parasitica var. nicotianae抑制效果的影响。结果表明电生功能水可以抑制体外烟草黑胫病菌，抑制率在27.2%～53.3%之间。当有效氯含量大于一定值时（ACC＞30 mg/L）和浸没时间相同的条件下，StAEW和SAEW（pH 5.0～6.0）对烟草黑胫病菌的抑制率没有显著差异。通过实验确定的最佳处理时间间隔是48 h，且无论浸没时间长短，抑制率都高于46.7%。可见，EOW可有效抑制烟草黑胫病菌的生长。

白粉病是温室观赏植物中普遍的、有破坏性的疾病之一。Mueller等［23］用EOW（理化指标：pH 2.7～2.8、ACC 49～54 μg/mL、ORP 1 050～1 053 mV）每周喷洒1 次或2 次显著减少了非洲菊的白粉病，从而验证了EOW可替代温室中的传统杀菌剂。并且，EOW对植物没有明显伤害［24］，加上EOW对许多真菌孢子和菌丝的广谱活性，使得EOW成为在温室控制疾病有前途的方法之一。

作者利用自主设计的连续式微酸性电生功能水生成系统制作了具有不同理化指标的3 种微酸性电生功能水（表1），并研究了这3 种不同指标的电生功能水对苹果链格孢属真菌孢子悬浮液中真菌孢子萌发率的影响，结果如图2所示，随着加入SAEW的ACC升高，苹果链格 孢属真菌孢子萌发率显著降低。因此，微酸性电生功能水能够抑制苹果链格孢属真菌孢子的萌发率。

表1　电生功能水的理化性质Table1 Physicochemical parameters of SAEW

图2　苹果链格孢属真菌孢子4 h和8 h萌发率Fig.2 Percentage of germinating spores of Alternaria from apple after treatment with SAEW for 4 and 8 h

2.2EOW用于控制食源性微生物

一些腐败菌、酵母菌和霉菌在生鲜食品中较为常见［25-26］，水果和蔬菜在田间生长、采收和采后处理、加工和流通过程被病原微生物污染［27］。为了防治食源性微生物，目前已研究了多种杀菌剂［28］，在食品工业如鲜切产业广泛使用的杀菌剂有Cl2、H2O2、有机酸、臭氧［29-30］和NaClO等。随着人们生活节奏的加快和生活水平的提高，鲜切水果和蔬菜的销售额逐年增长，由病原菌引起的食源性疾病在世界范围内时有发生，在加拿大、美国、英国、日本等很多国家都有相关报道［31-33］。因此，开发安全有效的控制食品中病原微生物的方法是食品企业HACCP体系的重要步骤［34］。杀菌研究发现，EOW可以很好地替代其他化学消毒剂，所以关于EOW杀菌的研究越来越受到青睐。

常见的蔬菜如菠菜、大白菜、莴苣、萝卜芽中含有大量的致病菌，研究证明SAEW对Escherichia coli O157：H7、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus和Salmonella spp.抑制效果很好［35-37］。另外，AEW不造成腐蚀，贮存更稳定，对人体产生的危害小（逸出的氯气少）。研究还发现，NEW对西红柿、卷心莴苣、胡萝卜丝、鲜切的莴苣菜、玉米沙拉、四季沙拉上的E. coli O157：H7、Salmonella enteritidis、Listeria monocytogenes、Erwinia carotovora等都有抑制作用［13，38］，如西红柿经过N E W处理，表面的种群数量由5（lg（CFU/cm2））减小到不足1 （lg（CFU/cm2）），且用NEW处理过的西红柿样品和未处理过的西红柿感官评价不存在显著差别［13］。同时，NEW（50 mg/L）与氯水（120 mg/L）对几种鲜切果蔬如卷心莴苣、胡萝卜丝、鲜切的莴苣菜的杀菌效果接近［38］。所以EOW在控制食源性疾病领域推广前景广阔。

2.3EOW用于病毒灭活

近年来，国内猪呼吸与繁殖障碍综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）和假狂犬病（pseudorabies，PR）造成的经济损失严重［39-40］。Hao Xiaoxia等［41］研究了不同质量浓度的SAEW（ACC 30、50、70 mg/L）在不同处理时间（5、10、15 min）和不同温度（4、20、40、60 ℃）等条件下，杀灭PRRS病毒（PRRS virus，PRRSV）和PR病毒（PR virus，PRV）的效果，结果表明，SAEW可以有效杀灭PRRSV和PRV，且效果优于NaClO溶液处理组，SAEW（ACC 50 mg/L）可在10 min内完全杀灭这两种病毒，并且对宿主细胞没有显著影响；随着有效氯质量浓度的增加、处理时间的延长、温度的升高，SAEW抗病毒能力增强。但是对微酸性电生功能水抗病毒作用的机理还未研究清楚。随着机理的进一步深入研究，SAEW在养殖场推广应用的前景还很广阔。

Morita等［42］研究发现StAEW（理化指标：pH 2.34、ORP 1 053 mV、ACC 4.2 mg/L）可以抑制人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus-1，HIV-1），20 min内HIV-1的传染性完全消失。可能的机理是导致病毒表面的蛋白质失活；抑制病毒的酶，破坏病毒的蛋白质等。而且，StAEW比NaClO对乙型肝炎病毒表面抗原（epatitis B surface antigen，HBsAg）和HIV-1的灭活效率更高。Tagawa等［43］通过建立动物模型，证明了StAEW（理化指标：pH 2.15、ORP 1 153 mV、ACC 7.15 mg/L）可以有效地防止肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的传播。

2.4EOW用于毒素灭活

病原菌会产生毒素，单纯减少食源性病原菌并不能保证食品加工过程的安全，而EOW对于毒素的灭活效果引起了人们的兴趣。肠毒素是分子质量为27～30 kD的蛋白质。葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal enterotoxin，SEA）是造成食物中毒的主要肠毒素之一，小于0.2 μg的SEA会导致人体食物中毒，摄入0.4～0.8 ng/mL的SEA会使人在3～5 h内发病。Suzuki等［44］通过酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）等手段研究发现EOW（理化指标：pH 2.5～2.8、ACC 36.3 μg/mL、ORP 1 180 mV）可以灭活SEA。黄曲霉毒素是一种肝毒素，毒性为二甲基亚硝胺的75 倍，20多种衍生物中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）致癌最强。Zhang Qian等［45］研究发现经过AEW室温处理15 min后，花生中85% AFB1被处理掉。而且经过处理，花生中的营养素（蛋白质、脂质、碳水化合物成分）没有显著性变化，花生表皮的颜色也没有发生变化。他们认为电生功能水中有效氯是灭活毒素AFB1的主要成分，并通过设置处理组所用的杀菌剂分别为新制的AEW、碱性NaClO、接近中性的NaClO、酸性NaClO等说明了杀灭AFB1的有效氯形式主要是HClO，另外，强酸性条件对毒素AFB1的灭活也有一定的促进作用。

3　EOW杀菌条件优化

3.1EOW和其他方法的协同作用

超声波具有杀菌的功效，由于超声波裂解作用导致细菌细胞膜的破裂，超声波对颗粒的细化与分散作用，从而降低所需的有效氯量（本文中指Cl2）［46］。Ugarte-Romero等［47］利用超声波在频率为20 kHz、功率密度为0.46 W/mL的条件下研究了超声波辅助加热与传统加热方法对苹果汁的杀菌效果，结果发现，在同样温度下超声波辅助加热杀菌的效果优于单纯加热杀菌方法，经扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察，其主要机理是由于超声波作用在固液界面附近产生的“气穴”破裂而引起的“射流”造成了E. coli细胞壁的破裂，从而导致细胞的失活。通过超声波的辅助作用，促使有效氯成分HClO并进入细胞，从而提高了EOW的杀菌效果。

Forghani等［48］认为SAEW（理化指标：pH 5.2～5.5、ORP 500～600 mV、ACC 21～22 mg/L）的处理不能将食源性微生物的量减小到安全范围，因此采用微酸性电生功能水与超声波（ultrasonication，US，40 kHz，400 W/L）和清水冲洗（water wash，WW）的组合方式，对大白菜、莴苣、芝麻叶和菠菜等进行了处理，测量指标包括酵母菌和霉菌、总细菌数量、E. coli、Listeria monocytogenes的微生物减少量等，结果发现，组合处理方式的效果显著优于单独采用微酸性电生功能水、超声波和清水冲洗处理方式时的效果（P＜0.05）。

Khayankarn等［49］采用AEW和超声波的组合来研究菠萝采后腐烂问题。他们首先分别采用AEW（ACC 100、200、300 mg/L，处理时间为0、10、20、30 min）及超声波（108、400、700、1 000 kHz，处理时间为0、10、30、60 min）处理Fusarium sp.（镰刀菌）孢子，根据抑制孢子萌发的结果选择效果最优的AEW和超声波处理，然后通过超声波、AEW浸泡和超声波处理三步来研究对果实腐烂与品质的影响，包括对好氧微生物及酵母菌、霉菌数量、水果腐烂率、溶解固形物含量（total soluble solids，TSS）、可滴定酸度（titratable acidity，TA）等的影响，得出1 MHz超声波和电解水的组合处理对于减少腐烂率、延长货架期的效果最好。

Liu Rui等［50］通过研究发现先用AlEW浸泡糙米，同时超声波处理30 min再放在SAEW中8 h可以显著增强杀菌能力（P＜0.05）。同样，Xie Jun等［51］证实经AlEW预处理后再用AEW处理的方法增强了抑制副溶血性弧菌污染的效果。

3.2环境对EOW的影响

不同的农产品对杀菌剂的杀菌活力也会产生影响。动物产品如虾、肉都富含蛋白质（有的也含有脂肪），而水果和蔬菜则富含碳水化合物［52］。即使少量的蛋白质和脂质也可以和EOW中的有效氯成分（如HClO）反应，使HClO含量迅速降低［53］，因此EOW的生物膜渗透能力差，这是造成EOW杀菌效率下降的主要原因之一［54-55］。有效氯可通过氧化还原反应与许多无机物或有机物（VC等）反应，降低其含量，例如有效氯与氨、氨基酸反应会形成一些化合物如N-氯代氨基酸；有效氯与脂质中的C=C反应（即不饱和脂肪酸链）；在有效氯含量高的情况下与糖的反应。总之，在食品产业、农业、医学上，有机物会使AEW中的有效氯成分发生形式的改变，变为化合物的形式，降低其杀菌效率［55］。

贮存环境对EOW的品质影响很大。Cui Xiaodong等［56］研究认为NEW比AEW稳定，AEW需要放置在一个密闭容器中防止有效氯（影响抗菌指标的主要因素之一）散失。Horiba等［57］也证明NEW可以在无光的密闭容器中保持恒定的pH值和ORP值，从而具有抑菌、杀菌的作用。有观点认为，EOW温度的升高有利于EOW杀菌能力的增强，Xie Jun等［58］发现用AEW处理，随着温度升高到50 ℃，剩余总细菌数、真菌数都随之逐渐减少。但是，50 ℃高温只适用在一些肉制品等的加工中，不适合果蔬加工，Xie Jun等［58］针对不同温度，采用实验室自制的SAEW（表1）抑制苹果链格孢属真菌的效果进行研究，发现温度未对抑菌圈的直径产生显著性影响（图3），所以还应针对杀菌对象的不同需要进一步探讨。Hsu等［59］研究发现当功能水半开贮存12 d，会造成DO（溶解氧）和总余氯含量（有效氯）分别减少81%和47%，其减少程度比延长贮存时间9 d更严重。Koide［60］和Len［61］等研究发现避光可以减少有效氯的损失，光线可能会诱导有效氯成分的自身分解。

图3　温度对SAEW抑制苹果链格孢属真菌生长的影响Fig.3 Influence of temperature on growth inhibition of Alternaria from apple by SAEW

3.3EOW冻结

在食品领域，研究AEW制成冰后发挥它的杀菌等作用是一个新的热点。EOW制成的冰对于食品保鲜和杀菌很有潜力［59］。Kim等［62］对比EW-ice（电生功能水制成的冰）与TW-ice（自来水制成的冰）对秋刀鱼微生物学、化学、感官品质方面的影响。他们采用的EW-ice的有效氯含量为34 mg/kg，是使用pH值为5、ACC为47 mg/L的一种接近微酸性的电生功能水制成。发现EW-ice明显抑制了秋刀鱼肉中的需氧菌和嗜冷细菌的生长。EW-ice也抑制了挥发性盐基态氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）、硫代巴比妥酸反应产物、碱性化合物的形成。另外，贮存在EW-ice中的秋刀鱼货架期比贮存在TW-ice中的秋刀鱼货架期长4～5 d。同样，Wang Jingjing等［63］研究发现，AEW-ice比TW-ice对熟虾上的副溶血性弧菌的杀菌效果更明显，防止TVBN的形成更有效。TVBN是新鲜和冷冻海鲜产品常用的品质指标之一［64-65］。高TVBN值和肉中的不愉快气味是相关的［66］。

Koseki等［67］发现AEW-ice产生的氯气是其具有杀菌作用的主要因素，AEW-AlEW混合物制成的冰对莴苣没有杀菌效果，不能减少微生物种群的数量。

4　EOW杀菌机理

关于EOW的杀菌主要成分，许多研究表明有效氯含量越高，杀菌效果越好［6，55，68］，有效氯包括次氯酸、次氯酸根离子或溶解的单质氯等，次氯酸是EOW具有杀菌能力的最有效形式，其次是次氯酸盐。HClO可以通过氧化核酸和蛋白质来破坏微生物细胞结构［16］。一些微生物细胞质酶中的巯基会被HClO氧化，可能会造成酶的失活，而且产物会抑制碳水化合物代谢途径中重要的葡萄糖氧化，使微生物无法正常代谢，从而杀死微生物细胞。也有研究认为NEW的杀菌效果主要是ACC和ORP的联合抗菌效果［5］。

Monnin［4］和Liao［69］等认为高ORP值使EOW具有杀菌效果。ORP与游离氯关系密切［4，45］。Liao等［69］的研究指出通过电子显微镜学和荧光测量技术显示出高氧化还原电位（ORP）值可以破坏E. coli O157：H7的外部膜和内部膜，造成E. coli O157：H7失活。失活的机理可能是：首先，破坏E. coli O157：H7中GSSG（氧化型谷胱甘肽）/2GSH（谷胱甘肽）氧化还原态的稳定（2HClO+ 2GSH=GSSG+H++H2O+Cl-），破坏了E. coli O157：H7的结构和功能，严重的氧化应激会耗尽能量储存，破坏产能结构，导致与细胞凋亡相关的结构变化无法被修复；然后渗入E. coli O157：H7的外层和内层膜；最后导致E. coli O157：H7的坏死。也有类似观点指出高ORP值可破坏病原体的细胞壁膜，导致病原体细胞内的渗透压或类氢过载［70］。细胞膜受损导致膜两侧水转移量增加，导致水进入细胞的速率大于排出的速率，从而短时间内产生极大的压力，最终造成细胞爆炸或死亡，而病原菌无法抵抗这样的物理破坏过程。结合EOW有效氯成分及Acher等［71］的理论，有效氯中部分成分杀菌的功效应为：Cl2＞ClO2＞ClO-。

而超声波与SAEW的组合会进一步提高杀灭微生物的效率，与超声波的作用机制密不可分，它会产生局部的高压与高温，破坏微生物细胞壁，导致更多的SAEW被其吸收［72］，结果导致最大量的细胞损伤［73］。另外，局部的高压和高温导致的微机械振动可能将一些细胞去除掉，也会使一些细胞的接触变的松动。从而使细胞更容易与次氯酸充分接触［74］。超声波处理有延长货架期的开发潜能［75］。

5　结 语

目前，EOW用于控制植物病害、食源性致病菌、水果防腐等方向已有了一定研究，可以用于指导农业、食品工业中的生产实践。但是目前仍存在的一些问题，主要包括：1）Audenaert等［76］研究表明EOW在体外实验和体内实验均可控制镰孢菌属，但是，由于氧化应激反应，NEW也造成了镰孢菌属产生的真菌毒素（如DON）的增多。即会有造成食物中毒问题的风险。可见利用

EOW抑菌的方法需要进一步优化，如通过延长浸泡时间、增加浸泡次数等方法再次将真菌毒素杀死；2）多数涉及真菌的实验都未在大田中进一步研究，如我们实验室所做的EOW抑制烟草黑胫病菌实验未在大田中继续研究［22］；3）EOW控制食源性疾病的研究，应考虑实际的商业条件下，按照不同种类的水果和蔬菜（具有不同的病原菌）进行实验，为工业化生产确定合适的处理时间、温度、浸泡次数等。所以如何把AEW合理的加入到食品厂的危害分析与关键控制点（hazard analysis and critical control point，HACCP）体系、药品生产质量管理规范（good manufacturing practice，GMP）、卫生标准操作程序（sanitation standard operation procedure，SSOP）中需要进一步的实践研究；同时，需要对EOW的杀菌动力学过程进行研究，以便为工业化应用提供技术指导；4）EOW所产生的刺激性气味对消费者感官评价的影响等。这些问题需要进一步的研究和讨论。

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Recent Progress in Research on Inhibition of Microorganisms and Their Toxins by Electrolyzed Functional Water

JIA Guoliang1， SHI Jingying2， LI Fade1，*
（1. College of Mechanical and Electronic Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；2. College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

In recent years， increasing attention has been paid to the applications of electrolyzed oxidizing water （EOW）for inhibiting or disinfecting microorganisms， owning to its many advantages such as the broad-spectrum bactericidal activity with high efficiency， low-cost， safety and eco-friendliness. Nowadays， strongly acid electrolyzed water （StAEW）is used widely. In addition， there have also been some reports concerning the applications of slightly acidic electrolyzed water （SAEW） and neutral electrolyzed water （NEW） in the fields of agriculture and food processing. With the deepening of the research， some issues including the synergistic effect of EOW and other processing methods on the inhibition or the disinfection of microorganisms， the active ingredients and the mechanism of action of E OW， and the conditions for sterilization using EOW have been addressed. This paper reviews the latest research progress in the inhibition of microorganisms and in the disinfection and inactivation of viruses and toxins by EOW. Moreover， existing problems in the current research and future direction for the development of EOW are also discussed in this review.

electrolyzed oxidizing water （EOW）； microorganism； agriculture； food； disinfectant

TS3；Q93

A

1002-6630（2015）03-0265-07

10.7506/spkx1002-6630-201503050

2014-03-26

农业部引进国际先进农业科学技术计划（948计划）资助项目（2009-Z38）

贾国梁（1991—），男，硕士研究生，研究方向为食品加工新技术，电生功能水的应用。E-mail：276648252@qq.com

李法德（1962—），男，教授，博士，研究方向为农产品与食品工程新技术等。E-mail：lifade@sdau.edu.cn