表达新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因重组鸭肠炎病毒的构建

梁殊林，李慧昕，陈洪岩，刘胜旺，

（1. 东北农业大学 生命科学学院，哈尔滨 150030；2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 禽呼吸道病创新团队，哈尔滨 150001；3. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 实验动物中心， 哈尔滨 150001）

表达新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因重组鸭肠炎病毒的构建

梁殊林1，李慧昕2，陈洪岩3，刘胜旺1，2

（1. 东北农业大学 生命科学学院，哈尔滨 150030；2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 禽呼吸道病创新团队，哈尔滨 150001；3. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 实验动物中心， 哈尔滨 150001）

目的构建表达新城疫病毒血凝素神经氨酸酶（HN）基因的重组鸭肠炎病毒（DEV）。方法利用同源重组技术，在DEV Clone-03基因组中胸苷激酶（TK）基因内部插入新城疫病毒HN基因。以本实验室已构建的rDEV TK-EGFP株为亲本病毒，将病毒基因组与转移载体共转染及蚀斑纯化，获得表达新城疫病毒HN基因的重组鸭肠炎病毒。结果重组病毒经基因水平和蛋白水平的鉴定，证明新城疫病毒HN基因正确插入DEV基因组内部且有效表达；复制动力学和遗传稳定性检测，证明重组病毒rDEV TK-HN滴度略有下降，但复制趋势与亲本病毒一致；在鸡胚成纤维细胞（CEF）和SPF鸡胚连续传代20代，表明HN基因随病毒传代而稳定遗传、表达。结论利用同源重组技术，对鸭肠炎病毒基因组进行修饰，构建了TK基因缺失表达新城疫病毒HN基因的重组鸭肠炎病毒，该病毒能够携带HN基因稳定遗传和表达。

鸭肠炎病毒（DEV）；新城疫病毒（NDV）；血凝素神经氨酸酶（HN）基因；重组病毒；基因修饰

鸭病毒性肠炎（Duck viral enteritis，DVE），又称鸭瘟（Duck plague，DP），是由鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性、热性和败血性传染病。其特征是流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率很高［1］。该病于1923年由Baudet首次在荷兰报道［2］，随后相继发现于法国、美国、印度、比利时、英国、泰国和加拿大，我国于1957年在广州首次发现本病，此外该病在南京、上海、武汉等地也有流行［3，4］。根据作者研究组的流行病学调查，在山东免疫后的鸭群中仍有鸭病毒性肠炎的爆发［5］，给养鸭业造成了巨大的经济损失。

近年来，新城疫对鸭的感染呈上升趋势，我国不断有鸭发生新城疫（Newcastal disease）或从野鸭分离到新城疫病毒（Newcastal disease virus，NDV）的报道。2005在河北省某鸭场的维鸭感染了新城疫［6］，证明了家鸭也能感染NDV并引起发病。2006年蔡丽姬等［7］从江苏某生态自然保护区发病的野鸭中成功分离到3株鸭新城疫毒株。2006年石跃等［8］从黑龙江三江自然保护区野生绿头鸭的泄殖腔拭子样品分离到一株基因Ⅲ型的野鸭NDV。这些都对我国养鸭业造成巨大危害。

DEV基因组中有多个复制非必需基因，可容纳外源基因的插入［9，10］。本研究对DEV基因组进行基因修饰，将其基因组中胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）基因插入缺失，插入新城疫病毒的血凝素神经氨酸酶（HN）基因。NDV HN蛋白位于病毒粒子囊膜外表面，兼具有HA和NA两种活性即具有识别细胞膜上的唾液酸受体并与之结合以及破坏这种结合的活性［11，12］。构建TK基因缺失表达NDVHN基因重组鸭肠炎病毒，通过病原的基因修饰，改变病原的基本生物学特性，以期建立能够同时检测鸭肠炎病毒和新城疫病毒的的检测方法，为实验用鸭的疫病净化检测奠定基础。

1　材料与方法

1.1病毒、细胞与鸡胚

重组鸭肠炎病毒rDEV TK-EGFP由本实验室构建，DEV Clone-03由本实验室保存。9～10日龄SPF鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2质粒与菌种

载体PMD18-T simple购自大连宝生物公司，携带NDV HLJ-1-06株病毒HN基因的质粒pUS10-HN由本实验构建。感受态由本实验室制备。

1.3酶类与主要生化试剂

ExTaq DNA聚合酶、HS PrimeStar高保真酶、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、NcoI、BamH I等限制性内切酶、质粒精提试剂盒和胶回收试剂盒购自大连宝生物公司；病毒基因组提取试剂盒购自天根公司；质粒大量提取试剂盒购于Omega公司。

1.4引物

应用Oligo7.0软件，以GenBank上发表的DEV Clone-03基因组序列（ACC.No.DQ227739）为参考，设计引物T1、T4，用于扩增TK基因及其侧翼序列。

T1: 5'-GACGTGTTGGCATCGGTTC-3'；

T4: 5'-CCATGTGCAGCATTACGATGTC-3'

以本研究室已经构建的质粒pUS10-HN模板设计引物P6、Pbupper，用于扩增含有HN基因的表达盒。

P6: 5'-GCGGCGACGGACAAACCACAACTAGAA-3'；

Pbupper: 5'-CGGCTCGAGTAGTTATTAATAGTAATCA -3'

1.5同源臂pTK的扩增和克隆

提取DEV Clone-03的基因组，应用引物T1、T4 进行PCR扩增，将PCR产物克隆至PMD18-T simple载体中，构建同源臂pTK，并进行PCR、酶切鉴定并测序。将pTK用NcoI酶切，T4 DNA聚合酶补平末端后，胶回收纯化。

1.6转移载体pTK-HN的构建

以实验室构建的pUS10-HN质粒为模板，以P6和Pbupper为引物，扩增含有HN基因的表达盒。将PCR产物克隆至上述已经处理的pTK，筛选阳性克隆，进行PCR、酶切鉴定并测序。

1.7重组病毒的筛选和鉴定

以本研究室构建的rDEV TK-EGFP为亲本毒株，根据同源重组的原理，利用应用转染试剂将病毒基因组与转移载体pTK共转染接种鸡胚成纤维细胞（CEF），当病变达70%～80%收获病毒并进行蚀斑筛选。在荧光显微镜下挑取无荧光的蚀斑，并进行PCR鉴定及测序鉴定。经3轮蚀斑筛选，获得纯化的重组病毒经Western blot和间接免疫荧光（IFA）检测HN蛋白的表达。按《分子克隆》［13］中所述方法进行Western blot，经一抗、二抗作用后DAB显色。间接免疫荧光按《分子克隆》［13］所述操作。在接毒后12 h、24 h、48 h和72 h检测感染细胞，经固定、一抗和二抗作用后，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.8重组病毒的复制动力学

将重组病毒以0.001 MOI （multiplicity of infection，感染复数）接种铺有CEF单层的12孔板，分别于接种后12 h、24 h、48 h、72 h和96 h收集细胞及其培养上清，每个时间点收集3个独立孔，按Reed和Muench方法进行TCID50测定并绘制生长曲线。

1.9重组病毒遗传稳定性

将重组病毒在CEF连续传代至20代，每5代进行PCR、Western blot和间接免疫荧光检测，检测重组病毒在基因水平和蛋白水平的遗传稳定性。将重组病毒接种CEF细胞，待细胞病变效应（CPE）达到80%～90%时收获病毒，连续传代20代。同时将重组病毒接种SPF鸡胚，接毒72 h后收毒，连续传代20代。每5代进行PCR、间接免疫荧光、Western blot检测。

2　结果

2.1同源臂pTK的鉴定

对质粒pTK进行酶切鉴定和PCR鉴定，对重组质粒用Mlu Ⅰ（5.6 kb）、Not Ⅰ（5.6 kb）、Sal Ⅰ（5.6 kb）、Xho Ⅰ（5.6 kb）、BamH Ⅰ（2.1 kb+3.5 kb）和Nco Ⅰ（5.1 kb+0.5 kb）进行酶切鉴定。利用引物T1、T4进行PCR检测，获得约2.9 kb大小的片段。酶切结果、PCR结果与预期结果一致（图1）。

1: Mlu Ⅰ酶切鉴定pTK；2: Not Ⅰ酶切鉴定pTK；3: Sal Ⅰ酶切鉴定pTK；4: Xho Ⅰ酶切鉴定pTK；5: BamH Ⅰ酶切鉴定pTK；6: Nco Ⅰ酶切鉴定pTK；M: DL15000 DNA Marker；7: PCR鉴定pTK图 1　同源臂pTK的鉴定1: pTK digested by Mlu Ⅰ；2: pTK digested by Not Ⅰ；3: pTK digested by Sal Ⅰ；4: pTK digested by Xho Ⅰ；5: pTK digested by BamH Ⅰ；6: pTK digested by Nco Ⅰ；M: DL15000 DNA Marker；7: Identification of pTK by PCRFigure 1　Identification of homologous arm pTK

2.2转移载体pTK-HN的鉴定

分别用Mlu I、Hind Ⅲ、Nhe Ⅰ、Not Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和Hpa Ⅰ限制性内切酶对转移载体pTK-HN进行酶切鉴定，片段大小与预期一致（图2）。用HU+HL（1.7 kb）和P6+Pbupper（预期2.6 kb）两对引物进行PCR检测，并用引物对T1+Pbupper（预期3.2 kb）、P6+T4（预期4.4 kb）进行交叉PCR检测，电泳结果与预期大小一致（图2）。将质粒送华大基因公司测序，测序结果与预期结果一致。

2.3重组病毒的蚀斑纯化与鉴定

1: Mlu Ⅰ酶切鉴定pTK-HN；2: Hind Ⅲ酶切鉴定pTK-HN；3: Nhe Ⅰ酶切鉴定pTK-HN；M: DL15000 DNA Marker；4: Not Ⅰ酶切鉴定pTK-HN；5: EcoR Ⅴ酶切鉴定pTK-HN；6: Pst Ⅰ酶切鉴定pTK-HN；7: SmaⅠ酶切鉴定pTK-HN；8: Hpa Ⅰ酶切鉴定pTK-HN；9: 以HU+HL为引物PCR；10: 以P6+Pbupper为引物PCR；11: 以T1+Pbupper为引物PCR鉴定；12: 以P6+T4为引物PCR图 2　转移载体pTK-HN的PCR和酶切鉴定1: pTK-HN digested by Mlu Ⅰ；2: pTK-HN digested by Hind Ⅲ；3. pTK-HN digested by Nhe Ⅰ；M: DL15000 DNA Marker；4: pTK-HN digested by Not Ⅰ；5: pTK-HN digested by EcoR Ⅴ；6: pTK-HN digested by Pst Ⅰ；7: pTK-HN digested by Sma Ⅰ；8: pTK-HN digested by Hpa Ⅰ；9: PCR by prime HU and HL；10: PCR by prime P6 and Pbupper；11: PCR by prime T1 and Pbupper；12: PCR by prime P6 and T4Figure 2　Identification of transfer vector pTK-HN by PCR and restriction enzyme analysis

2.3.1蚀斑纯化亲本病毒rDEV TK-EGFP基因组中的EGFP被新城疫的HN基因替换，所以重组病毒不会表达绿色荧光蛋白。在荧光显微镜下挑取不表达绿色荧光蛋白的重组病毒蚀斑进行扩增培养并进行鉴定，经过三轮蚀斑纯化，获得纯化的重组病毒，将该重组病毒命名rDEV TK-HN。分别利用PCR、Western blot和间接免疫荧光等方法对rDEV TK-HN重组病毒进行检测。蚀斑纯化结果（图3），三张图片从左到右分别是在可见光下、绿色荧光、可见光和绿色荧光同时打开下拍摄。纯化后进行PCR检测、酶切检测以及交叉PCR检测（图4）。

A1～3: 第一代重组病毒rDEV TK-HN蚀斑形态；B1～3: 第二代重组病毒rDEV TK-HN蚀斑形态；C1-3: 第三代重组病毒rDEV TK-HN蚀斑形态图 3　重组病毒rDEV TK-HN蚀斑形态A1-3: F1 plaque morphology of recombinant virus rDEV TK-HN；B1-3: F2 plaque morphology of recombinant virus rDEV TK-HN；C1-3: F3 plaque morphology of recombinant virus rDEV TK-HNFigure 4　Plaque morphology of recombinant virus rDEV TK-HN

1: PCR鉴定重组病毒；2: BamH Ⅰ酶切PCR产物；M: 250 bp DNA Marker；3: 以T1+HU为引物PCR；4: 以HL+T2为引物PCR图 4　重组病毒rDEV TK-HN PCR、酶切和交叉PCR检测1: Identification of recombinant virus by PCR；2: PCR products digested by BamH I；M: 250 bp DNA Marker；3: PCR by prime T1 and HU；4: PCR by prime HL and T2Figure 4 Identification of recombinant virus rDEV TK-HN by PCR，restriction enzyme analysis and cross-PCR

2.3.2间接免疫荧光和Western blot检测间接免疫荧光检测，在荧光显微镜下拍照如图5。感染重组病毒的CEF中可见荧光，说明重组病毒与鸡抗HN抗体反应，重组病毒中HN基因获得表达。对照CEF不与鸡抗HN抗体发生反应（图5）。

Western blot检测结果表明，重组病毒rDEV TK-HN能够正确表达NDV HN蛋白，大小约为74 000，与预期糖基化HN蛋白大小一致，而在DEV Clone-03 和CEF对照中未检测到HN蛋白条带（图6）。

2.3.3复制动力学的测定复制动力学结果表明，重组病毒rDEV TK-HN与其亲本毒rDEV TK-EGFP病毒滴度相近，生长趋势相似，在感染后72 h病毒滴度达到高峰，感染后96 h开始下降。与野生型病毒DEV Clone-03相比，重组病毒滴度略有下降（图7）。

A: CEF细胞对照；B: CEF感染rDEV TK-HN后12 h；C: CEF感染rDEV TK-HN后24 h；D: CEF感染rDEV TK-HN后48 h；E: CEF感染rDEV TK-HN后72 h图 5　间接免疫荧光检测重组病毒rDEV TK-HN感染单层CEF细胞后HN基因的表达情况A: CEF control；B: CEF 12 h post infection with rDEV TK-HN；C: CEF 24 h post infection with rDEV TK-HN；D: CEF 48 h post infection with rDEV TK-HN；E: CEF 72 h post infection with rDEV TK-HNFigure 5　Expression of HN gene in recombinant virus rDEV TK-HN detected by IFA

M: Prestained protein marker；1: 重组病毒rDEV TK-HN尿囊毒；2: DEV Clone-03尿囊毒；3: 未接毒尿囊液对照图 6　Western blot检测重组病毒HN基因的表达M: Prestained protein marker；1: Allantotoxicon of the recombinant virus rDEV TK-HN；2: Allantotoxicon of DEV Clone-03；3: Allantoic fluid controlFigure 6　Expression of HN gene in recombinant virus detected by Western blot

2.4遗传稳定性鉴定

图 7　重组病毒rDEV TK-HN生长曲线Figure 7　Recombinant virus rDEV TK-HN replication curve

对重组病毒rDEV TK-HN每5代进行PCR、间接免疫荧光和Western blot检测。应用HN基因特异性引物HU+HL，能够检测到HN基因，大小约1.7 kb，表明NDV HN基因随重组病毒的传代而稳定遗传（图8）。间接免疫荧光结果表明，重组病毒在传代至5、10、15、20代时能够检测到HN蛋白的表达（图9），说明重组病毒在CEF和鸡胚中连续传代至20代，HN蛋白能够随重组病毒的传代而稳定表达。

M: 250 bp marker；1: 第5代PCR；2: 第10代PCR；3: 第15代PCR；4: 第20代PCR图 8　重组病毒rDEV TK-HN F5、F10、F15、F20代的PCR检测结果M: 250 bp marker；1: F5 PCR；2: F10 PCR；3: F15 PCR；4: F20 PCRFigure 8　Identification of the 5th、10th、15th and 20th of the recombinant virus rDEV TK-HN by PCR

3　讨论

鸭病毒性肠炎是鸭的一种重要疫病，鸭感染该病毒后潜伏期通常为2～5 d，病鸭、潜伏期感染鸭及病愈不久的带毒鸭是该病的传染源，带毒时间可长达4年［14，15］。水禽是新城疫病毒的主要携带者，鸭等水禽感染新城疫后死亡率较高。近年报道的感染水禽的新城疫主要是基因Ⅶ型新城疫，它对水禽的致病性较高。

图 9　间接免疫荧光检测rDEV TK-HN重组病毒F5、F10、F15、F20 HN基因表达Figure 9　Expression of HN gene in the 5th、10th、15th and 20th of the recombinant virus rDEV TK-HN detected by IFA

为了建立能够同时检测鸭肠炎病毒和新城疫病毒的检测方法，对实验动物培育和疫病检测净化提供基础，本研究利用同源重组技术将DEV Clone-03基因组进行改造，构建表达NDV HN基因的重组鸭肠炎病毒。与其亲本毒DEV Clone-03和rDEV TK-EGFP相比，重组病毒的蚀斑形态和大小与亲本病毒一致，病毒滴度下降了近十倍，与Wang等［16］构建的较亲本毒毒力下降50～100倍的重组病毒相比，本研究选择的插入位点对病毒复制的影响相对较小。IFA检测表明在重组病毒感染CEF后12 h即可检测到HN基因的表达，随着感染细胞的增加HN基因的表达量也逐渐增加。在生长曲线和遗传稳定性进行研究中，重组病毒滴度略有下降，但复制趋势与亲本病毒一致。重组病毒连续传代20代，每五代进行PCR、Western blot和IFA检测，结果表明HN基因随病毒体外传代稳定遗传且稳定表达。综上，通过DEV病原的基因修饰，构建了TK缺失表达NDV HN基因的重组鸭肠炎病毒且重组病毒能够携带NDV HN基因稳定遗传，以期建立能够同时检测鸭肠炎病毒和新城疫病毒的检测方法，为实验动物（鸭等水禽）培育和疫病的检测和净化奠定了基础。

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Construction of Recombinant Duck Enteritis Virus with HN Gene of Newcastle Disease Virus

LIANG Shu-lin1，LI Hui-xin2，CHEN Hong-yan3，LIU Sheng-wang1，2
（1. College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2. Innovation Team of Disease of Avian Respiratory Tract，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China；3. Experimental Animal Center，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150001，China）

ObjectiveTo construct the recombinant duck enteritis virus （DEV） expressing the HN gene of Newcastle disease virus （NDV）. MethodsThe HN gene of NDV was inserted into TK gene of DEV Clone-03 by homologous recombination technology. rDEV TK-EGFP which was constructed as parent virus，by means of cotransfection of the viral genome and transfer vector and plaque purification，the recombinant duck enteritis virus was obtained expression the HN gene of Newcastle disease virus. ResultsThe HN gene of NDV was inserted into DEV genome correctly and expressed effectively on gene and protein level. Replication kinetics and the genetic stability detection of the recombinant virus rDEV TK-HN proved that the titer of rDEV TK-HN decreased slightly，but the trend was consistent with the parent virus replication. After 20 passages in chicken embryo fibroblast and SPF chicken embryos，it showed that the HN gene was of good genetic and expression stability with the passage of the virus. ConclusionBy homologous recombination technology and modifying duck enteritis virus genome，the recombinant virus which could carry the HN gene of NDV was constructed and the virus was of good genetic and expression stability.

Duck enteritis virus （DEV）；Newcastle disease virus （NDV）；HN gene；Recombinant virus；Genetic modification

Q95-33

A

1674-5817（2015）03-0195-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.03.004

2014-12-26

梁殊林（1988-），女，硕士，动物学，E-mail: liangshulin2010@163.com

刘胜旺（1969-），男，研究员，博士生导师，E-mail: swliu@hvri.ac.cn