田亚平, 陈 洋, 于 雷, 侯东军, 曹忠君, 姜艳彬*
(1.中国动物疫病预防控制中心,北京 102609; 2.铁岭市畜产品安全检测站,辽宁铁岭 112000)
喹诺酮类药物是一类人工合成的具有4-喹诺酮环结构的药物,因其具有抗菌谱广、杀菌力强、吸收快、体内分布广泛、不良反应小,以与其他抗菌药无交叉耐药性等特点,被广泛应用于治疗动物各类感染[1,2]。目前,兽用中药制剂中存在非法大量添加抗生素、抗病毒药等化学药品,喹诺酮类药物就是其中的一种,这不仅易造成动物源性食品中药物残留,且给人们身体健康造成巨大伤害[3]。
目前,喹诺酮类药物残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等[4-9]。超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)联用技术,结合UPLC的高分离能力和质谱提供结构信息的功能,具有灵敏度高、选择性强的优势,尤其是串联质谱技术的应用,可以获得丰富、有效的化合物结构信息,建立快速、高效的分析研究体系[10]。本方法旨在建立一种快速简便、专属性强、灵敏度高的UPLC-MS/MS方法,用以测定兽用中药散剂中喹诺酮类药物。
Acquity UPLC超高效液相色谱-Quattro premier XE质谱联用仪(Waters公司);AE260电子天平(Mettler Toledo公司);Biofuge Strators高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技);Organomation Associates氮吹仪(Jnc公司);VORTEX 1漩涡混合器(IKA公司);MassLynx v 4.1数据处理软件(Waters公司);HLB小柱(3 cc,HLB;Waters公司)。
培氟沙星(Pefloxacin)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、恩诺沙星(Enrofloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、伊诺沙星(Enoxacin)、吡哌酸(Pipemidic Acid)、萘啶酸(Nalidixic Acid)、西诺沙星(Cinoxacin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、达氟沙星(Danofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、二氟沙星(Difloxacin)、沙氟沙星(Sarafloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)14种对照品,纯度均大于98.0%(Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯(Fisher公司);三氯乙酸为分析纯。实验用水为超纯水。
分别准确称取14种喹诺酮类药物对照品0.0100 g,甲醇溶解,并定容于100 mL容量瓶中,配制成100.0 μg·mL-1的混合标准储备液。准确吸取混合标准储备液1.0 mL至100 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,即得1.00 μg·mL-1的混合标准工作液。
阴性样品:止痢散(爱德森(北京)生物科技有限公司);四味穿心莲散(江苏省徐州仙潮药业有限公司)。以上两种中兽药散剂均购买于合格厂家,经检测不含喹诺酮类药物。
阳性添加散剂:按照0.5%、1.0%和2.0%的比例在阴性对照散剂中添加14种喹诺酮对照品,混匀。
称取中药散剂1.0 g,加水10.0 mL,超声溶解。HLB柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化,待溶液流至填料上层以下,加5.0 mL样品提取液至HLB柱中,控制流速小于3 mL/min,然后用3 mL水淋洗,抽干,3.0 mL甲醇洗脱,将洗脱液于30 ℃下氮气吹干。残余物用初始流动相2.0 mL溶解,涡旋混匀,以10 000 r·min-1的速率高速离心10 min。取适量上清液,0.45 μm微孔滤膜过滤,供UPLC-MS/MS测定。
色谱条件:色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm);流动相:A相为甲醇,B相为0.05%甲酸水溶液,梯度洗脱:0~10.0 min,3.0%~90.0%A;10.0~10.1 min,90.0%~3.0%A;10.1~13.0 min,3.0%A;流速为0.25 mL·min-1;柱温为30 ℃;进样量为10 μL。
质谱条件:电喷雾正离子源;毛细管电压为3.5 kV;锥孔电压为3.0 V;RF透镜电压为0.5 V;离子源的温度为110 ℃;脱溶剂温度为350 ℃;脱溶剂气流速为650 L·h-1;锥孔反吹气流速为50 L·h-1。
为了提高分析的灵敏度和专一性,选用多反应监测(MRM)模式进行检测,并同时进行定性和定量的双离子通道分析,进一步提高该方法的准确性和专属性。喹诺酮类药物定性和定量离子对列于表 1。
为了提高方法的灵敏度,本实验进行多时间段的MRM(mpMRM),即按照待测药物的保留时间,分为多个时间段分别进行MRM扫描,具体测定条件见表1。mpMRM数据采集模式在一个循环中检测多个药物,节约分析时间,尤其是mpMRM灵敏度高,能够检测含量较低的待测组分。
表1 14种喹诺酮类药物的保留时间、定性和定量离子对及MRM参数Table 1 Retention time,quantitative and qualitativeion-pair,and MRM parameters of 14 quinolone drug
(续表1)
2.2.1专属性阴性样品中添加14种喹诺酮类药物(10.0 μg·mL-1),并按照前处理方法进行处理,实验结果表明,14种喹诺酮类药物能和中药散剂中的其他物质完全分离,没有干扰。
2.2.2线性关系和检测限准确吸取适量的混合标准工作液,用流动相稀释成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL-1的系列空白添加试样,然后进行UPLC-MS/MS测定。以各药物定量离子的色谱峰面积(Y)为纵坐标,样品浓度(X,ng·mL-1)为横坐标,绘制标准曲线,并计算检出限(LOD,S/N>3)和定量限(LOQ,S/N>10),结果见表2。可以看出14种喹诺酮类药物在1.5~200.0 ng·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数(r)均大于0.990。
表2 14种喹诺酮类药物的标准曲线、相关系数、定量限和检测限Table 2 Calibration curves,correlation coefficients,LODs and LOQs of 14 quinolone drug
2.2.3精密度和回收率按照高(2.0%)、中(1.0%)、低(0.5%)3个不同比例,添加14种喹诺酮类药物混合溶液到阴性中药散剂中,每个浓度测定6个样本,按照1.4处理样品,与对照品平行进样分析,用外标法定量,本实验的回收率为95.1%~106.3%,相对标准偏差为2.3%~4.8%。结果表明各样本回收率和精密度符合分析要求。
在市场中随机购买兽药20份,用建立的方法对样品中的喹诺酮类药物进行检测,结果在20份样品中,发现1份名为“病毒灵”的兽用中药散剂中含有恩诺沙星和诺氟沙星,进一步表明本研究所建立的方法有效,能够检测到兽用中药散剂中的喹诺酮类药物,且有一定的实用性。
本文采用UPLC-MS/MS法同时测定兽用中药散剂中14种喹诺酮类药物。该方法中质谱扫描采用mpMRM模式,从而显著提高检测灵敏度,适合对兽用中药散剂中的喹诺酮类药物进行测定。本研究对市场购买的样品进行了检测,发现1份阳性样本,进一步验证了该方法的有效性和实用性。