规模化奶牛场子宫内膜炎病原菌的分离鉴定、药物敏感性试验及其致病性分析

秦佳晨，王新庄

（1.洛阳市高新区畜牧防疫检疫中心，河南 洛阳　471000；2.河南农业大学牧医工程学院）

规模化奶牛场子宫内膜炎病原菌的分离鉴定、药物敏感性试验及其致病性分析

秦佳晨1，王新庄2

（1.洛阳市高新区畜牧防疫检疫中心，河南 洛阳471000；2.河南农业大学牧医工程学院）

通过调查平顶山市某规模化奶牛场奶牛子宫内膜炎的病原菌及其耐药性，为下一步建立子宫内膜炎病例模型和研究奶牛子宫内膜炎的病因及发病机理提供基础。该试验采用细菌分离培养和微生物鉴定系统对所采集的样品进行细菌分离培养、纯化、鉴定；同时采用微量稀释法测定所分离细菌的药物敏感性，最后通过昆明小鼠腹腔接种进行致病性试验。结果表明：从29份样品中共分离到18种细菌，它们均对阿莫西林、氨苄西林存在较高的耐药性，对环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考均表现敏感，而对其他药物的敏感性各种细菌间存在较大差异性；通过致病性试验可知所分离的18种细菌中致病性最强的分别是大肠埃希菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、停乳链球菌、苏云金芽孢杆菌、产吲哚金黄杆菌，且它们均分离于产后两月后患病牛的样品中。

奶牛；子宫内膜炎；病原菌；药敏试验；致病性试验

子宫内膜炎是引起奶牛产后不孕症的主要因素，该病主要是因分娩时或产后子宫内病原微生物的感染而引起。据统计由子宫内膜炎引起的不孕症占疾病性不孕的60%～70%［1］。在国外有资料表明，奶牛子宫内膜炎的发病率在30%～40%左右。国内报道，我国奶牛子宫内膜炎的发病率约为20%～50%左右。母牛发生子宫内膜炎后可使产犊间期延长、产奶量下降、死淘率增加、治疗费用增加及治疗期间奶源的废弃。有研究表明，引起奶牛子宫内膜炎的病因与病原微生物的感染、饲养管理水平、内分泌紊乱及继发性疾病等因素有关，但以病原微生物的感染为主。然而子宫内膜炎患病牛在不同的地区不同的牛场从子宫内容物中所分离的病原菌种类及各种细菌所占的比例均不相同。当下在兽医临床上对于奶牛子宫内膜炎的预防和治疗普遍采用的是抗菌药物，使得细菌的耐药性日益突出。该试验对平顶山市某奶牛场子宫内膜炎患病牛子宫内容物中的细菌进行分离鉴定、药物敏感性试验和昆明小鼠的致病性试验，结果表明样品中分离到的大肠埃希菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、停乳链球菌、苏云金芽孢杆菌、产吲哚金黄杆菌具有较强的致病性。以上5种致病性较强的细菌均存在于产后两月龄以后的奶牛子宫样品中，它们的持续存在可能是导致子宫内膜炎难以治愈及子宫难以复旧的根本原因。该试验着重对样品中的细菌进行分离、鉴定，通过药敏试验分析细菌的耐药性，通过致病性试验获得5种致病性较强的细菌，这些将对研究该规模场子宫内膜炎的发病原因及致病机理提供基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品

在平顶山市某奶牛场确诊为临床型子宫内膜炎的29头患病牛采集子宫内容物（样品号标记为N1～N29）。子宫内膜炎病牛的诊断主要是在临床调查的基础上，通过临床症状及B型超声诊断相结合的方法进行确诊。

1.1.2药品、试剂、仪器

阿莫西林对照品（规格100 mg，含量86%，批号K0221001），克拉维酸钾（50 mg，130535-200301），氨苄西林（200 mg，85.8%，K0210906），替米考星对照品（200 mg，91.0%，K0310711），盐酸环丙沙星（100 mg，100.0%，H0100803），恩诺沙星（100 mg，99.8%，H008094），头孢噻呋（200 mg，87.5%，K0330406），头孢氨苄（200 mg，94.2%，30408-200209），庆大霉素（200 mg，每毫克相当于612庆大霉素单位，K0070806），安普霉素（200 mg，每毫克相当于560安普霉素单位，K0230811），盐酸四环素（200 mg，97.5%，130488-200403），多西环素（200 mg，86.0%，0485-9901），氯霉素（200 mg，99.5%，K0350706），氟苯尼考（100 mg，含量99.3%，K0301004），粘菌素（200 mg，每毫克相当于粘菌素22156单位，K0270905），林可霉素（100mg，84.9%，K0101003），泰乐菌素（200 mg，每毫克相当于泰乐菌素1026单位，K0160911），青霉素（100 mg，92.2%，K0251006），链霉素（300 mg，每毫克相当于712单位，K0051201），盐酸土霉素（200 mg，每毫克相当于938土霉素单位，K0030712），磺胺氯吡嗪钠（200 mg，H0281009），盐酸金霉素（200 mg，94.5%，K0020710），红霉素（200 mg，每毫克相当于883红霉素单位，K0120906），头孢他啶（100 mg，84.2%，130484-200502），以上药品均购自中国兽医药品监察所。肉汤A培养基、胰蛋白胨大豆琼脂、麦康凯琼脂培养基、双抗巧克力琼脂培养基、改良沙氏琼脂培养基、厌氧菌琼脂、血液琼脂基础培养基等，购自青岛渊博生物技术有限公司。SENSITITRE革兰氏阳性鉴定板GPID（批号B9263P），SENSITITRE革兰氏阴性鉴定板GNID（批号B0413）。全自动微生物鉴定及药敏分析系统（型号SENSITITRE ARIS 2X），生物显微镜（日本NIKON，型号ECLIPSE55I），电子分析天平（梅特勒-托利多仪器，型号XP205），隔水式培养箱（上海精宏实验设备有限公司，型号GNP-9160），MILLI-Q纯水仪（MILLIPORE公司），比浊仪，超净工作台（苏净安泰）等。

1.2方法

1.2.1奶牛子宫内膜炎患

病牛子宫内容物的采集

采用直肠把握子宫法人

工授精术式通过输精管采集

子宫内容物。由操作者通过直肠握住子宫角，将输精管从阴门插入到子宫体、子宫角，再让助手在输精管端连接50 ml注射器抽取子宫内容物。如不易抽出可先注入20～30 ml灭菌生理盐水，由操作者按摩子宫壁使生理盐水与子宫内容物充分接触后再抽取内容物，并尽快将内容物放入灭菌过的EP管用封口膜封口。

1.2.2子宫内容物中细菌的分离培养、纯化及鉴定

将新鲜的子宫内容物接种到肉汤A培养基，放入37℃恒温培养箱中增菌18～24 h后，分别在血液琼脂平板、马铃薯葡萄糖琼脂、改良沙氏琼脂培养基、厌氧菌琼脂培养基中划板培养。其中血液琼脂平板放入37℃恒温培养箱；马铃薯葡萄糖琼脂和改良沙氏琼脂培养基放入25～30℃培养箱；厌氧菌琼脂培养基采用焦性没食子酸法［7］放入烛缸内培养。通过菌落形态特征及革兰氏染色特性将各平板上生长的不同菌落挑出接种于肉汤A培养基，培养18～24 h后再划板培养，接连几次并结合显微镜观察即可将所分离到的菌株纯化。将纯化好的细菌挑取单个菌落于5 ml去离子水中，并用先德比浊仪进行比浊使其达到0.5麦氏单位，按照鉴定系统的加样步骤及使用程序进行。

1.2.3药物敏感性试验

药物敏感性试验采用微量肉汤稀释法，向96孔V型板每板的第1列8个孔自上而下依次在96孔塑料微孔板上加入各种药物15 μl，吸取32 μl已比浊好达到0.5麦氏单位的菌液于平皿中加入MH肉汤按1∶1000稀释，用微量移液器将每板的第1列加入135 μl稀释的菌液，以后各列加入75 μl菌液，第1列各孔混合均匀后吸出75 μl加入第2列各孔中，同法依次两倍稀释至第11列各孔，弃去75 μ l，每板的最后一列做空白对照。置于37℃恒温培养箱中培养18 h，读取结果，以无细菌生长孔内所含抗菌药物的最低浓度为最低抑菌浓度（MIC）。每株细菌至少做两个以上重复试验（平行试验），取其平均值。每株细菌用3块板，共用24种药物。

1.2.4致病性试验

将38只5周龄健康昆明小鼠，采用全价饲料饲喂使其体质量达到25 g以上并注意观察各自的健康状况。将从奶牛子宫内膜炎患病牛子宫内容物中所分离出的18种细菌的新鲜培养物通过小鼠腹腔攻毒进行致病性试验。

2　结果

2.1样品的采集结果

该次试验共采集不同年龄、胎次及产后不同时间段的子宫内膜炎患病牛子宫内容样品29份，具体的样品采集时间及编号结果见表1。

表1　母牛产后样品的采集时间

2.2样品中细菌的分离、培养结果（见表2和表3）

在29份样品中，N13、N15、N20、N21 4份样品未分离到细菌，其他样品均分离到了细菌。从表2中可以看出样品中有1种细菌存在的有13份样品，占44.8%；样品中有2种细菌存在的有3份样品，占10.4%；样品中有3种细菌存在的有5份样品，占3.4%。在产后30 d内的11份样品中，N15、N20、N21号牛样未分离到细菌，N2、N3、N16号牛样均分离到了1种细菌，N14号牛样分离到了3种细菌，N1、N4、N9号牛样均分离到4种细菌，N11号牛样分离到了6种细菌；在产后31～60 d内的9份样品中，N13号牛样未分离到细菌，N8、N17、N22号牛样均分离到了1种细菌，N5、N6、N27号牛样均分离到了2种细菌，N10、N18号牛样均分离到了3种细菌；在产后61～90 d的4份样品中，N7、N19、N25号牛样均分离到了1种细菌，N12号牛样分离到了3种细菌；在产后91 d以上的5份样品中，N23、N24、N26、N28号牛样均分离到了1种细菌，N29号牛样分离到了3种细菌。从采牛样的胎次及分娩时是否发生了难产而经过人工助产来看：采自初产牛的10份样品中，除了N28号样牛，其余9份牛样均在分娩时发生了难产而人工助产过，因此说难产的发生与牛子宫内膜炎的发病率有一定相关关系。初产牛的10份样品中，N15、N20号牛样未分离到细菌，N3、N16、N19、N28号牛样均分离到了1种细菌，N10、N12号牛样均分离到了3种细菌，N1号牛样分离到了4种细菌，N11号牛样分离到了6种细菌；从采自2胎牛的17份样品来看，N13、N21号牛样未分离到细菌，N7、N8、N22～N26号牛样均分离到了1种细菌，N5、N6、N27号牛样均分离到了2种细菌，N14、N18、N29号牛样均分离到了3种细菌，N9号牛样分离到了4种细菌；从采自3胎牛的2份样品来看，N2号牛样分离到了1种细菌，N4号牛样分离到了4种细菌。

表2　每份样品中分离到的细菌数

表3　采样牛的胎次及分娩时是否实施助产

2.3细菌的染色结果（见表4）

表4　分离到的细菌革兰氏染色特性

从表4中可以看出，该次试验共分离出18种（52株）细菌，其中革兰氏阴性菌有28株，占53.8%；革兰氏阳性菌有24株，占46.2%。从细菌的形态上分类，球菌有8株，占15.4%；球杆菌有2株，占3.8%；杆菌有42株，占80.8%。说明该奶牛子宫内膜炎患病牛的子宫内容物中病原菌以革兰氏阴性菌为主，而在细菌形态上以杆菌为主。

2.4细菌的鉴定结果

该试验共对29头子宫内膜炎患病奶牛子宫内容物进行分离、纯化、鉴定，共鉴定出细菌18种。其中有12份样品中有蜡样芽孢杆菌存在，占样品数的71.4%；有6份样品中存在奥斯陆莫拉菌，占样品数的24%；有5份样品中存在大肠埃希菌，占样品数的20%；有4份样品中存在链球菌，占样品数的16%；苏云金芽孢杆菌、浅黄金色单胞菌、耶尔森菌属、产吲哚金黄杆菌、产碱假单胞菌各有3份样品中存在，占样品数的12%；玫瑰色库克菌与成团泛菌各有2份样品中存在，占样品数的8%；屎肠球菌、表皮葡萄球菌、棒状杆菌属、痢疾志贺菌、食酸代尔夫特菌、脑膜炎脓毒性金黄杆菌各有1份样品中存在，占样品数的4%。由此可见，平顶山地区奶牛子宫内膜炎患病牛子宫内容物中病原菌以蜡样芽孢杆菌、奥斯陆莫拉菌、大肠埃希菌、链球菌为主，其次是苏云金芽孢杆菌、浅黄金色单胞菌、耶尔森菌属、产吲哚金黄杆菌、产碱假单胞菌，最后是玫瑰色库菌、成团杆菌、屎肠球菌、表皮葡萄球菌、棒状杆菌属、痢疾志贺菌、食酸代尔夫特菌、脑膜脓毒性金黄杆菌。

2.5样品中所分离细菌的体外药物敏感性试验结果

对样品中所分离的18种细菌在不同类药物中选用2～3种药物（共选取24种药物）进行药敏试验。每种细菌对24种药物的药敏试验结果均在2～3次平行试验的基础上取平均数所得。从试验结果可以看出：所分离的18种细菌对阿莫西林、氨苄西林均存在较高的耐药性［除食酸代尔夫特菌（对氨苄西林的MIC值为64 μg.ml-1）外的所有细菌对阿莫西林和氨苄西林的MIC值均为128 μg.ml-1或以上］，但当阿莫西林、氨苄西林与克拉维酸合用时多数细菌又较为敏感。而大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、玫瑰色库克菌、棒状杆菌属对阿莫西林、氨苄西林与克拉维酸合用仍表现为耐药，但MIC值均有所降低。蜡样芽孢杆菌对庆大霉素、安普霉素、粘菌素、链霉素表现为耐药，而对其他药物较为敏感。奥斯陆莫拉菌对粘菌素、红霉素、林可霉素表现为耐药，对青霉素表现为中介，而对其他药物较为敏感。苏云金芽孢杆菌对安普霉素、粘菌素、链霉素、林可霉素均耐药，对头孢噻呋和庆大霉素表现为中介，而对其他药物较为敏感。耶尔森菌属对青霉素表现为中介，而对其他药物较为敏感。乳房链球菌对庆大霉素、安普霉素及链霉素耐药，对土霉素表现为中介，而对其他药物较为敏感。大肠埃希菌对林可霉素耐药，对头孢氨苄表现为中介，而对其他药物均敏感。表皮葡萄球菌对四球素、替米考星、金霉素、红霉素、林可霉素均耐药，而对其他药物较为敏感。浅黄金色单胞菌对头孢他啶耐药，对青霉素表现为中介，而对其他药物较为敏感。产碱假单胞菌对粘菌素、林可霉素、头孢他啶均耐药，而对其他药物较为敏感。玫瑰色库克菌对庆大霉素、安普霉素、粘菌素、链霉素均耐药，对青霉素表现为中介，而对其他药物较为敏感。屎肠球菌对头孢噻呋、安普霉素、粘菌素、链霉素、头孢他啶均耐药，而对其他药物较为敏感。棒状杆菌属对四环素、多西环素、替米考星、土霉素、金霉素、红霉素、林可霉素均耐药，而对其他药物较为敏感。成团泛菌对粘菌素、土霉素耐药，而对其他药物较为敏感。志贺氏菌属对四环素、替米考星、青霉素、链霉素、土霉素、金霉素、红霉素、林可霉素耐药，对头孢他啶表现为中介，而对其他药物较为敏感。停乳链球菌对安普霉素、粘菌素、青霉素、土霉素、红霉素、林可霉素耐药，而对其他药物较为敏感。

2.6致病性试验结果

将38只健康成年昆明小鼠随机分为19组并将小鼠编号，其中1～18组为各种细菌的攻毒组；19组为空白对照组（腹腔注射等量的生理盐水）。将18种细菌的新鲜培养物通过腹腔注射0.5 ml/只（约1.05×109cfu/ml）进行攻毒。攻毒后注意观察小鼠的精神、饮食及死亡情况，连续观察72 h以上并记录小鼠伤亡情况。对于死亡小鼠及时剖解，并取病变脏器回收所接种的细菌。结果表明：样品中所分离的大肠埃希菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、停乳链球菌、苏云金芽孢杆菌、产吲哚金黄杆菌在腹腔攻毒后2 d内均可使昆明小鼠致死，并可从剖检后病变脏器中分离到攻毒时所接种的细菌。

3　分析与讨论

对平顶山市某奶牛场确诊为临床型子宫内膜炎的29头患病牛子宫内容物进行了分离培养、鉴定，共分离出18种细菌。由此可见，产后子宫内的细菌种类较多。从产后患病牛样品的采集时间及每份样品中分离到的细菌数可以看出，该场子宫内膜炎患病牛的子宫内容物中病原菌以单一细菌存在为主。这与赵红琼［3］、杨克礼［4］、陈现伟［5］等报道的奶牛子宫内膜炎的感染以单一菌株感染为主相一致。

分离到的病原菌有蜡样芽孢杆菌、奥斯陆莫拉菌、大肠埃希菌、链球菌、苏云金芽孢杆菌等18种，这与淮安地区［6］、金华地区［7］报道的奶牛子宫内膜炎病原菌类似。但各种病原菌在样品中存在的比例不完全相同。从所分离细菌的革兰氏染色情况来看，该场奶牛子宫内膜炎的病原菌以革兰氏阴性菌为主（占53.8%）［8-9］。这与陈现伟［5］、赵红琼［3］、许微微［10］等人报道的在奶牛子宫内膜炎致病菌中阳性菌检出率很高及王国卿、田文儒［11］等人报道的产后正常奶牛子宫内细菌的变化规律中阳性菌检出率较高不一致，这可能是菌群的地域性差异。

从药敏试验结果可以看出，所分离的18种细菌对阿莫西林、氨苄西林均存在较高的耐药性。但当阿莫西林、氨苄西林与克拉维酸合用时所有细菌的MIC值均有所下降，可以推测所分离的这些细菌可能已经能够产生β-内酰胺酶。从所分离的18种细菌的药敏试验结果可以看出，18种细菌对环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考均表现为敏感，因此在临床治疗上推荐使用氟喹诺酮类、氯霉素类药物及两者与β-内酰胺酶抑制剂合用可能效果较为理想。但在临床用药时应使用足够的剂量和适当的疗程，并注意定期轮换。

从致病性试验结果可以看出，在样品中所分离到的18种细菌中致病性最强的是大肠埃希菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、停乳链球菌、苏云金芽孢杆菌、产吲哚金黄杆菌。这些致病性较强的细菌并非在每份样品中都存在，特别是N15、N20、N21号牛样品中未分离到细菌仍患有子宫内膜炎。以上5种致病性较强的细菌均是从产后两月后的子宫内膜炎患病牛的样品中分离到的，这些致病性细菌的存在可能是导致子宫仍没有复原的主要原因。引起子宫内膜炎的病因是复杂的，通常是由多种复杂的因素相互作用的结果，而细菌是多种复杂因素中的主要因素之一。

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S858.23

B

1004-5090（2015）12-0003-04

2015-10-05）