奥扎格雷对酪氨酸酶的抑制机理

赵仕芝

摘 要：奥扎格雷不仅能抑制酪氨酸酶单酚酶的活性，而且能够抑制酪氨酸酶二酚酶的活性。对单酚酶的抑制作用主要表现为抑制酶活，并且使得酶催化反应的延滞时间有明显的延长，而对二酚酶的抑制作用，主要表现为抑制二酚酶酶活。同时，讨论了酚氧化酶的催化氧化的机理：酶和底物结合后，会形成一个新的疏水性的“口袋”，抑制剂奥扎格雷会嵌入这个“口袋”，形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。

关键词：酪氨酸酶 奥扎格雷 单酚酶 二酚酶 抑制机理

中图分类号：Q356.1 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）06（c）-0249-02

奥扎格雷（ozagrel）是一种新型抗血小板聚集药，药理研究表明，奥扎格雷能强力抑制TXA2合成酶的活性，从而抑制血小板聚集，同时提高前列环素PGI2的浓度，扩张血管，增加血流量，有效抑制脑血栓的形成，使已形成的血栓靠血液平衡关系的打破而被自行溶解，达到治疗脑梗塞之功效。该文研究了奥扎格雷对蘑菇酪氨酸酶的抑制动力学。该研究结果为进一步的设计高效酪氨酸酶抑制剂奠定理论基础，并为奥扎格雷及其衍生物作为食品防腐剂、果蔬保鲜剂以及美白化妆品的添加剂阐明了它们作用的酶学机理，为新型高效酪氨酸酶抑制剂的开发提供了新的分子模板。

1 实验方法

1.1 酪氨酸酶活力测定

酪氨酸酶单酚酶活力测定：1.5mmol/LL-酪氨酸为底物，在pH6.8的磷酸盐缓冲液中，30℃恒温10分钟，加入不同浓度的奥扎格雷溶液和酶溶液，在475nm波长下测定吸光度OD值。

酪氨酸酶二酚酶活力测定：1.0mmol/LL-DOPA为底物，在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中，30℃恒温10分钟，加入不同浓度的奥扎格雷溶液和酪氨酸酶溶液，在475nm波长下测定吸光度OD值。

2 结果与讨论

2.1 奥扎格雷对酪氨酸酶单酚酶的影响

如图1所示，奥扎格雷具有抑制蘑菇酪氨酸酶单酚酶酶活。测定不同浓度的奥扎格雷浓度对酪氨酸酶单酚酶作用的进程曲线，曲线1-5分别表示奥扎格雷在测酶活体系中的浓度为0、10、20、30和40mol/L。图1结果表明，奥扎格雷能延长酶反应的延滞时间（曲线的直线部分交于X轴的值），并随着奥扎格雷浓度的增大而延长。在相同反应时间下，反应体系的吸光度值随着奥扎格雷浓度的增大而下降，说明奥扎格雷对酪氨酸酶的单酚酶活性有抑制作用。延滞期过后，酶催化体系逐渐达到了稳态（曲线的直线部分）。相对抑制率达到50%的奥扎格雷浓度（IC50）为1.35mmol/L。

2.2 奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶的影响

以L-DOPA为底物测定酪氨酸酶二酚酶酶活，反应进程曲线如图2 （曲线0-5）。在测活条件体系中，加入酶液后，反应迅速进入稳态，产物与时间呈线性递增，直线部分为酶催化底物反应级数为一级反应，随着时间的延长，酶受到奥扎格雷的抑制，导致酶活下降，从而反应级数逐渐的由一级反应转变为零级反应。在不同的奥扎格雷浓度条件下，随着奥扎格雷浓度的增加，一级反应区域 （曲线直线部分） 的斜率逐渐减小，即奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶酶活的抑制程度增大。

2.3 催化机理

在氧气存在条件下，酪氨酸酶的基本功能有两个：作为单酚酶羟基化单酚生成邻二酚（图3）；作为双酚酶氧化邻二酚生成醌（图4）。该酶具有包含两个铜离子位点的活性中心，并与不同数目的氧原子配位结合具有三种不同状态，分别为氧化态Eoxy，还原态Emet和脱氧态Edeoxy。氧化态Eoxy兼具单酚酶和二酚酶的活性；还原态Emet具有二酚酶的活性，不具有单酚酶活性，但是和单酚底物具有亲和作用，所以还原态Emet是延滞效应产生的原因；脱氧态Edeoxy的作用是只能结合氧。所以，酪氨酸酶催化单酚类底物都是从Eoxy开始，Emet和Edeoxy均不与单酚类底物反应，Eoxy和Emet两者都可以催化多酚类底物。

奥扎格雷能够延长单酚酶的延滞时间，降低单酚酶和二酚酶的稳态速率，说明奥扎格雷能够可逆的抑制酪氨酸酶并阻止多巴色素的生成，进而能够遏制黑色素的生成。并且，对于二酚酶体系而言，奥扎格雷不仅能和还原态酶Emet和氧化态酶Eoxy结合分别形成对应的酶-抑制剂复合物EmetI和EoxyI，而且还能和酶-底物复合物EmetI和EoxyI分别形成对应的酶-底物-抑制剂复合物EmetSI和EoxySI。同时，根据奥扎格雷对酪氨酸酶二酚酶的混合型抑制机理，这一过程可表示为：（如图5所示）

其中E（Emet，Edeoxy和Eoxy）、D、I和P分别表示酶的三种形态、底物L-DOPA、奥扎格雷和产物，EI、ES和ESI分别表示酶-抑制剂复合物、酶-底物复合物和酶-底物-抑制剂复合物。从酪氨酸酶角度分析，该酶存在两个结合位点，一个可与底物结合，另一个与抑制剂结合。当底物与酶结合过程中，酶的天然构象会发生一些形变，在这个变化过程中，酶的疏水性的“口袋”会变大。然后，酶和底物结合后，会形成一个新的疏水性的“口袋”，抑制剂奥扎格雷会嵌入这个“口袋”形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。可以推断出，酶和底物-抑制剂复合物ES容易形成并且结合力更强。而比较竞争性和反竞争性的强弱，则可通过单酚酶的测试来旁证，在单酚酶测活体系中，延滞现象很容易被观察到。延滞期过后，反应体系才达到稳态。反推之，若奥扎格雷只与游离酶起作用，那样不仅降低稳态反应速率而且延长延滞时间；若奥扎格雷只与酶-底物复合物ES起作用，奥扎格雷仅降低稳态反应速率，而且不会延长延滞时间，但是奥扎格雷不仅降低了稳态反应速率，而且延长了延滞时间，则说明竞争性抑制效应要强于反竞争性抑制效应。

参考文献

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