浸浴条件下孔雀石绿对鳜鱼毒性效应的初步研究

孔雀石绿（malachite green，MG）又名孔雀绿、碱基绿，为翠绿色有光泽的结晶，属三苯甲烷类染料，极易溶于水，水溶液呈蓝绿色。在渔业生产中，孔雀石绿常被用作驱虫剂、杀虫剂、防腐剂，主要用于预防与治疗水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。近年来，不断有研究报道，孔雀石绿会在水产动物体内积累，产生高残留和高毒性，并且可通过食物链进入人体，具有潜在的致癌风险，威胁人类健康。因此，美国、英国、加拿大、日本和我国已明令禁止在水产养殖业中使用孔雀石绿。2002年5月，我国将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》，在水产养殖中，孔雀石绿的使用得到了有效遏制。然而，由于其具有抗菌、杀虫、保鲜等功效，加之易于获得、高效价廉且替代品少，在水产动物的孵化、育苗以及养殖、运输和销售等环节仍有违规使用的现象。

目前，关于孔雀石绿在水产动物方面的研究多集中在药物富集残留及消除代谢方面，涉及的水产动物有鲫鱼[1]、草鱼[2]、欧洲鳗鲡[3]、大菱鲆[4]、罗非鱼[5]、青石斑鱼[6]、中华绒螯蟹[7]、斑点叉尾鮰[8]以及乌鳢[9]和南美白对虾[10]等。有关孔雀石绿在养殖鳜鱼方面的研究，尤其是对鳜鱼的毒性效应研究鲜有报道。笔者从组织学角度研究了在孔雀石绿浸浴条件下，用药前后养殖鳜鱼的组织病理变化，以期为鳜鱼的科学育苗和养殖以及加强该类药物的监管提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 鳜鱼来源 鳜鱼购自澧县柳耳坝鱼类苗种繁育场，为人工繁养的翘嘴鳜，其体长为24.6±2.3 cm，体重为352.46±40.25 g。试验开始前，先暂养3 d，选取体表完好、体质健康的个体开始正式试验。

1.1.2 养殖条件 2014年，养殖试验在湖南省水产原种场繁育基地水泥池中（规格3.20 m×1.55 m×0.80 m）进行，采用微流水养殖，保持水质清新，水体溶氧充足，日换水量约为40%。试验期间，水体pH 值为6.42～6.86，水温为12～15℃，水体透明度为40～50 cm，叶绿素a 含量为0.17～0.24 mg/L，溶解氧含量介于5.57～6.74 mg/L。饵料鱼为人工繁殖的四大家鱼，由湖南省水产原种场提供，体长为4.5±1.2 cm，饵料鱼与鳜鱼的投放比例约为10︰1。

1.2 试验设计

孔雀石绿药浴试验在直径为1 m 的圆形塑料桶中进行，药浴完毕后转入水泥池中微流水饲养，分别设试验组和对照组。在水温为10±0.5℃，不间断充氧条件下，以5 mg/L 的孔雀石绿溶液浸泡鳜鱼120 m in，再将其转入水泥池中微流水饲养，分别在药浴30、60、90 和120 m in 时以及停药后第0.5、1、2、4、8、12、16、20、25 和30 d 采样；对照组除不药浴孔雀石绿溶液外，其他处理与试验组相同。每次随机采集3～5尾鳜鱼，其中部分用于孔雀石绿药物残留代谢检测，部分个体分别取其血液、皮肤、鳃、背肌、腹肌、肝脏、肾脏、脾脏及肠道用于组织切片观察。鳜鱼血液直接用玻璃片涂片吉姆萨染色后显微观察血液的细胞形态变化，其他组织用10%甲醛水溶液固定，采取HE染色法染色后显微观察用药前后鳜鱼不同机体组织的病理变化。

2 结果与分析

2.1 孔雀石绿用药前后鳜鱼血液中血细胞变化

用5 mg/L 的孔雀石绿溶液对鳜鱼进行药浴，并分别在药浴30、60、90 和120 m in 时以及停药后第0.5、1、2、4、8、12、16、20、25 和30 d 分别采样鳜鱼血液制成血涂片吉姆莎染色观察。结果表明，孔雀石绿药浴前后，鳜鱼的血液细胞在形态上与对照组鳜鱼并无显著差异，只是红细胞在细胞数量及密度水平上有所不同，见图1。

图1 孔雀石绿药浴前后鳜鱼的血液细胞形态

2.2 孔雀石绿用药前后鳜鱼皮肤、肌肉及鳃组织的变化

试验条件下，鳜鱼皮肤的组织切片结果表明，药浴期间，随着用药时间的延长，鳜鱼体表粘液增加，鳜鱼皮肤对孔雀石绿的应激反应逐渐加重，在组织病理学方面主要表现为上表皮层炎症细胞增多，停药转微流水养殖后，鳜鱼皮肤组织的炎症细胞逐渐减少，从第1～2 天开始基本与对照组鳜鱼一样，如图2 所示。

鳜鱼肌肉的组织切片结果表明，药浴期间及停药微流水养殖后，鳜鱼的背肌及腹肌组织与对照组鳜鱼基本一样，并无明显病理变化，如图3～图4 所示。

鳜鱼鳃的组织切片结果表明，随着药浴时间的加长，鳜鱼鳃丝充血加重，并出现肿胀症状，转入微流水后逐渐好转，与对照组无明显差异，鳃丝排列整齐，具有自然张力，鳃小片有规则地呈羽状互生排列，如图5所示。

2.3 孔雀石绿用药前后鳜鱼内脏组织的变化

鳜鱼肝脏的组织切片结果表明，药浴期间，随着时间的延长，鳜鱼肝脏充血，出现轻微肿胀，肝细胞间隙增大，排列紊乱，部分肝细胞空泡化、细胞质分布不均匀以及细胞核异位、固缩；转入微流水培养4～8 d 后症状逐渐好转，与对照组无明显差异，如图6 所示。

鳜鱼肾脏的组织切片结果表明，药浴期间，随着时间的延长，鳜鱼肾脏充血，出现轻微水肿症状；转入微流水培养1～2 d 后逐渐恢复正常，与对照组并无明显差异，如图7 所示。

图2 药浴前后鳜鱼皮肤组织切片

图3 药浴前后鳜鱼背肌组织切片

图4 药浴前后鳜鱼腹肌组织切片

图5 药浴前后鳜鱼腮组织切片

图6 药浴前后鳜鱼肝组织切片

图7 药浴前后鳜鱼肾脏组织切片

鳜鱼脾脏组织切片结果表明，药浴期间，随着时间的延长，鳜鱼脾脏充血，出现轻微水肿症状；转入微流水培养1～2 d 后逐渐恢复正常，只是细胞排列紧密程度有所不同，与对照组无明显差异，如图8 所示。

鳜鱼肠道组织切片结果表明，药浴期间及停药后，鳜鱼肠道只是杯状细胞数量上与对照组有所不同，其他方面并无明显差异，如图9 所示。

图8 药浴前后鳜鱼脾脏组织切片

图9 药浴前后鳜鱼肠道组织切片

3 讨论

3.1 孔雀石绿用药前后鳜鱼的血细胞变化

研究表明，孔雀石绿及其代谢物对水产动物的毒性不仅与暴露时间、用药浓度和水温条件正相关，而且与水质环境，尤其是水体pH 值、硬度和溶解氧的高低密切相关[11]。鱼类外周血细胞形态和数量的变化是机体在环境胁迫下敏感的特征性指标，红细胞微核率更是反映了其对外界应激反应的敏感程度。正常鳜鱼成熟的红细胞多呈椭圆形，表面光滑，核呈椭圆形或圆形，多位于细胞中央，吉姆莎染色后细胞核呈蓝紫色，细胞质呈较浅的红色（图1C）。周立红等[12]研究了鳙鱼和尼罗罗非鱼分别在0.02～0.50 mg/L 和0.2～1.0 mg/L 的孔雀石绿溶液中暴露7 d 后其红细胞微核率的变化特征，结果表明，鳙鱼对孔雀石绿比尼罗罗非鱼敏感，其红细胞微核率随者用药浓度的升高而增加。该研究结果表明，孔雀石绿药浴期间鳜鱼的红细胞在形态上与停药后期、对照组均没有明显差异，只是红细胞数量水平及密度较高，这可能与水体中缺氧，鳜鱼血液中红细胞的携氧运动有关。同时，试验组红细胞微核率与对照组并无明显差异，这与周立红等[12]人的研究结果有所不同，可能与试验对象、个体大小、药浴时间和浓度以及水质环境条件等有关。

3.2 孔雀石绿用药前后鳜鱼的皮肤、鳃以及肌肉组织变化

鱼类的皮肤是抵御外界环境的第一道屏障。试验条件下，药浴期间鳜鱼对孔雀石绿的应激反应较强，主要表现为鳜鱼体表粘液增加，皮肤上表皮炎症细胞增多，停药微流水养殖后，上述症状逐渐好转，这表明鳜鱼的皮肤组织具有自我调节功能。

鱼类的鳃不仅是气体交换、盐水交换的主要场所，同时也是代谢废物排泄的主要器官之一。Gerundo等[13]研究了虹鳟鱼在0.14 mg/L 孔雀石绿溶液中暴露30～60 d 后的组织病理变化，结果表明，虹鳟鱼在孔雀石绿中长时间暴露，可导致虹鳟鱼的鳃严重受损，鳃上皮细胞和片层细胞坏死，白细胞浸润。而该试验条件下，随着药浴时间的延长，鳜鱼鳃丝充血加重，出现肿胀，转入微流水后逐渐好转，并无其他病理变化，这与Gerundo 等人的研究结果有所不同，表明短时间药浴并不会对鳜鱼的鳃组织造成明显损害，其鳃丝与对照组一样，排列整齐，具有自然张力，鳃小片有规则地呈羽状互生排列。此外，药浴前后鳜鱼肌肉组织与对照组并无明显病理变化，表明用孔雀石绿短时间高浓度的药浴并不会对鳜鱼的肌肉组织造成损伤，这可能与孔雀石绿及其代谢物在肌肉组织的残留水平有关。

3.2 孔雀石绿用药前后鳜鱼的内脏组织变化

研究表明，孔雀石绿进入动物体内后，可以通过生物转化作用转化成脂溶性代谢产物——无色孔雀石绿[14]，其残留毒性比孔雀石绿更强，而且主要蓄积在血清、肝、肾、肌肉、皮肤及其他内脏中[15-16]。该试验条件下，孔雀石绿对鳜鱼内脏组织影响较大的是肝脏组织，可导致鳜鱼肝脏充血，出现轻微肿胀症状，肝细胞细胞间隙增大，排列紊乱，部分肝细胞空泡化、细胞质分布不均匀以及细胞核异位、固缩，这表明肝脏组织是孔雀石绿及其代谢物的主要靶器官，与Gerundo等对虹鳟鱼的研究有所不同，鳜鱼的肝脏细胞并未出现坏死和肝硬化，这可能与孔雀石绿的药浴时间、药浴浓度、鱼体种类以及环境条件等有关。同时，试验鳜鱼经微流水饲养4～8 d 后肝脏组织症状逐渐好转，与对照组并无明显差异，这表明孔雀石绿对鳜鱼肝脏造成的损伤是可逆的和可修复的。此外，对鳜鱼肾脏、脾脏以及肠道组织的研究显示，孔雀石绿短时间的药浴会对鳜鱼的肾脏和脾脏造成水肿及充血，影响肠道组织杯状细胞的数量，与Gerundo 等对虹鳟鱼的研究也有所不同，这也可能与试验对象、药浴时间及环境条件等有关。

浸浴条件下，孔雀石绿对鳜鱼的毒性大小与鳜鱼的个体大小、药浴浓度、药浴时间以及水质条件和天气状况等因素有关，其对鳜鱼的毒性效应是外部环境与鳜鱼组织机能综合作用的结果，有关孔雀石绿用药前后鳜鱼的血液组成及组织中酶活性变化以及毒性效应的形成机理还有待进一步深入研究。

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