孟鲁司特对嗜酸细胞胃肠炎幼鼠肠道炎症的抑制作用

张晓燕，吴 斌，刘俊红，卢建双，黄欢欢，洪舒婷

业已证实，孟鲁司特（montelukast，MK）是一种新型高选择性半胱氨酰白三烯受体（cysteinyl leukotriene receptor，CysLTR）拮抗剂，能特异性与CysLT1R结合，抑制半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes，CysLTs）所致的血管通透性增加、平滑肌收缩，抑制炎症递质和细胞因子的释放，预防和抑制嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）生长因子，如IL－3、IL－5、粒细胞集落刺激因子对 EOS等的促成熟作用，使外周血及器官局部EOS减少，减轻炎症反应［1］。近年来，临床上尝试将MK应用于嗜酸细胞胃肠炎（eosinophilic gastroenteritis，EG）的治疗。本研究采用卵白蛋白（ovalbumin，OVA）腹腔注射致敏联合灌胃激发建立Sprague－Dawley（SD）幼鼠EG模型，观察各组幼鼠肠黏膜炎症损伤、EOS密度、肥大细胞（mast cell，MC）密度及 MC脱颗粒率变化，探讨MK对EG幼鼠肠道炎症的抑制作用，为临床应用MK治疗EG提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 清洁级3周龄雌性SD幼鼠32只［许可证号：SCXK（沪）2007－0005，上海斯莱克实验动物有限责任公司］，体质量50～70g，采用不含鸡蛋蛋白的饲料饲养，饲养温度（23±3）℃，湿度50%～70%。根据有否造模、是否使用MK干预两因素两水平，按2×2进行排列组合，将32只幼鼠随机分成4组，分别为：造模＋未使用MK干预组（M1I0组）、造模＋使用 MK干预组（M1I1组）、未造模＋未使用MK干预组（M0I0组）和未造模＋使用MK干预组（M0I1组），每组8只。

MK（批号：J20070058，杭州默沙东制药有限公司）；OVA（批号：A5503－1G，美国Sigma公司），大鼠OVA－IgE ELISA 试剂盒（批号：100826，美国R＆D公司）；数码显微镜摄像系统（BX51，日本Olympus公司）；专业图像分析处理软件（Image－Pro Plus 6.0，美国 Media Cybernetics公司）。

1.2 方法

1.2.1 幼鼠EG模型建立及干预方法 参照文献［2］建立EG模型，即采用低剂量OVA腹腔注射致敏联合高剂量OVA灌胃激发建立EG幼鼠模型：在第0天给予每只幼鼠腹腔注射低剂量OVA和AL（OH）3混 悬液共 0.2mL［含 OVA 40μg，AL（OH）31mg］，在第2，4，7，9，11天腹腔注射低剂量 OVA 40μg（0.2mg／mL OVA溶液0.2mL）；在第 20，24，28，30 天给予高剂量 OVA 30mg（15mg／mL OVA 溶液2.0mL）灌胃激发。第20至30天，M0I1组和 M1I1组每天予10mg·kg－1·d－1MK灌胃给 药 1 次，MK 干预剂量参 照文献［3－4］。M0I0组和M1I0组同期予同等容量的生理盐水灌胃。

1.2.2 EG模型及 MK疗效评价 在末次激发后18～24h处死幼鼠，无菌条件下剪开腹腔，留取空肠约1cm，分成2段，其中一段石蜡包埋，H－E染色后进行常规病理检查和肠黏膜EOS计数；另一段速冻切片后进行肠黏膜MC观察和计数（累计10个高倍视野内MC总数及脱颗粒MC数）计算MC脱颗粒百分率：

通过观察各组幼鼠肠黏膜病理改变、肠黏膜中EOS、MC计数及MC脱颗粒情况，对EG幼鼠模型及MK干预效果进行评估。

1.3 统计学处理 结果以±s表示；采用SPSS 19.0统计软件进行分析。组间比较采用多样本完全随机设计方差分析，采用LSD法进行两两比较；采用析因方法分析各因素的效果。α＝0.05为显著性检验标准。

2 结 果

2.1 SD幼鼠空肠黏膜病理改变 M0I0组、M0I1组空肠肠黏膜形态基本完整，肠上皮完好，固有层无水肿、充血，未见炎症细胞浸润；M1I0组可见空肠肠黏膜破坏，小肠绒毛部分剥落，结构紊乱，绒毛上皮细胞局灶性脱落、坏死，固有层水肿、充血，大量炎症细胞浸润；M1I1组可见空肠肠黏膜破坏程度较轻，可见部分绒毛上皮细胞局灶性脱落、坏死，固有层轻度水肿、充血及炎症细胞浸润较M1I0组轻（图1）。

图1 各组SD幼鼠空肠黏膜病理变化（H－E ×200）Fig1 Groups of jejunum mucosa pathological changes in SD young rats（H－E ×200）

2.2 SD幼鼠空肠EOS密度 M0I0组、M0I1组幼鼠空肠黏膜内仅偶见散在的EOS，且EOS结构完整，无破碎；M1I0组空肠黏膜中有明显的EOS浸润、聚集，尤其是黏膜固有层内较明显；M1I1组空肠黏膜中仍有EOS浸润、聚集，但较M1I0组明显减少（图2）。

图2 各组SD幼鼠空肠黏膜中EOS表达（H－E ×400）Fig2 EOS expressed in jejunum mucosa of SD young rats（H－E ×400）

2.3 SD幼鼠空肠MC密度、MC脱颗粒率改变M0I0组、M0I1组空肠黏膜固有层偶见到散在的MC或者无MC，MC结构完整，轮廓清晰，无聚集、脱颗粒现象；M1I0组空肠黏膜内大量MC聚集，固有层较多，胞质颗粒呈紫红色，胞核呈蓝色，核形状不规则呈椭圆形或分叶状，伴胞膜破裂，轮廓不清，并向外排出紫红色颗粒；M1I1组空肠黏膜内MC聚集，固有层为主，部分伴胞膜破裂，轮廓不清，并向外排出紫红色颗粒，但较M1I0组明显减少（图3）。

2.4 SD幼鼠空肠EOS密度、MC密度、MC脱颗粒率改变的析因方差分析结果

2.4.1 SD幼鼠空肠EOS密度的析因方差分析结果 建立OVA－EG模型可显著增加幼鼠空肠黏膜中EOS密度，其引起幼鼠空肠黏膜中EOS密度增加的平均主效应为12.8／高倍视野（high power field，HPF）；使用MK干预则可显著降低幼鼠空肠黏膜中EOS密度，与未使用MK干预比较，其空肠黏膜中EOS密度降低的平均主效应为－5.1／HPF（表1）。

图3 各组SD幼鼠空肠黏膜中MC表达（甲苯胺蓝染色 ×400）Fig3 MC expressed in jejunum mucosa of SD young rats（TBS ×400）

表1 各组SD幼鼠激发后EOS密度2×2析因设计结果Tab1 The EOS density of ANOVA two－way factorial in SD young rats after excited

2.4.2 SD幼鼠空肠 MC密度的析因方差分析结果 建立OVA－EG模型可显著增加幼鼠空肠黏膜中MC密度，其引起幼鼠空肠黏膜中MC密度增加的平均主效应为3.1／HPF；其空肠黏膜中 MC密度，与未使用MK比较，使用MK干预治疗引起幼鼠空肠黏膜中MC密度降低的平均主效应为－4.6／HPF（表2）。

表2 SD幼鼠激发后MC密度2×2析因设计结果Tab2 The MC density of ANOVA two－way factorial in SD young rats after excited

2.4.3 SD幼鼠空肠 MC脱颗粒率改变的析因方差分析结果 建立OVA－EG模型可显著增加幼鼠空肠黏膜中MC脱颗粒率，其引起幼鼠空肠黏膜中MC脱颗粒率增加的平均主效应为42.3%；使用MK干预则可显著降低幼鼠空肠黏膜中MC脱颗粒率，与未使用MK干预比较，其空肠黏膜MC脱颗粒率降低的平均主效应为－15.4%（表3）。

表3 各组SD幼鼠激发后MC脱颗粒率2×2析因设计结果Tab3 The rate of MC degranulation of ANOVA two－way factorial in SD young rats after excited

2.4.4 SD幼鼠空肠黏膜EOS密度、MC密度、MC脱颗粒率的析因方差分析结果 幼鼠空肠黏膜中MC脱颗粒率受到建立OVA－EG模型和使用MK干预两个因素影响，F值分别为1 054.987，164.540，P值分别为0.000，0.000，建立 OVA－EG模型与使用MK干预之间存在交互作用（F＝162.373，P＝0.000），说明使用 MK干预可以降低建立OVA－EG模型引起的幼鼠空肠黏膜中MC脱颗粒率升高。在控制建立OVA－EG模型因素影响后，使用MK干预和未使用MK干预幼鼠空肠黏膜中MC脱颗粒率的边缘估计均值及95%可信区间 （95%CI）分别为：32.4（30.5，34.2）%，48.8（47.0，50.7）%，组间因素检验，差别有统计学意义（P＜0.05，表4）。

表4 幼鼠空肠黏膜EOS密度、MC密度、MC脱颗粒率的析因方差分析结果Tab4 The EOS density，MC density and MC degranulation rate of ANOVA factorial in jejunum mucosa of SD young rats

3 讨 论

LTs是过敏反应中重要的炎症介质，与过敏性疾病密切相关的为 LTB4、LTC4、LTD4，其中，LTC4、LTD4因含有半胱氨酰残基，故称为CysLTs。CysLTs主要由EOS、嗜碱性粒细胞和 MC释放，CysLTs作用于CysLTR，引起气道重塑和气道高反应；LTs可与其他多种炎性介质相互作用，选择性促进Th2型细胞因子如IL－4等的产生，诱导上皮细胞产生嗜酸性粒细胞趋化因子，加重组织的EOS炎症［5］。在CysLTR中，将能够被经典半胱氨酰白三烯受体拮抗剂（cysteinyl leukotriene receptor anta－gonist，CysLTRA）如 MK、扎鲁司特所拮抗的称为CysLT1R，而对MK等不敏感者称为CysLT2R。CysLTRA与CysLT1R特异性结合，阻断CysLTs在过敏反应中的作用，可以有效抑制EG的过敏反应，为EG的治疗提供一种新的途径。CysLTRA副作用少、耐受性好，且对哮喘的治疗有明显的效果，近年来部分临床医生尝试将其应用于EG的治疗。Quack等报道其所在医院1例确诊为EG的17岁女生采用强的松治疗时临床症状反复，后将强的松剂量增加至20mg／d，同时联合 MK 10mg／d治疗，症状消失后将激素减量并在6周内停用，单用MK治疗2年，临床症状完全消失，各项血液检查及内镜检查均正常［6］。本组中，M1I0组幼鼠在OVA致敏激发后出现轻度竖毛，毛发失去光泽，活动减少，大便为成形稀便，其空肠肠黏膜形态结构破坏，小肠绒毛部分剥落，结构紊乱，绒毛上皮细胞局灶性脱落、坏死，固有层水肿、充血，大量炎症细胞浸润；M0I0、M0I1组幼鼠在激发前后一般情况无明显变化，毛发有光泽，无竖毛现象，活动如常，运动敏捷，大便成形；使用MK干预治疗后，M1I1组幼鼠与没有干预的EG模型组幼鼠比较，其竖毛减少，活动增加，大便明显成形，且幼鼠空肠肠黏膜破坏程度减轻，仅见部分绒毛上皮细胞局灶性脱落、坏死，固有层轻度水肿、充血，炎症细胞浸润有所改善。这表明MK可以改善OVA致敏激发所致的临床症状及肠道炎症损伤。

目前对于CysLTRA治疗EG的机制尚无明确、统一的结论。Wan等采用OVA致敏建立的EG的BALB／c小鼠模型，探讨 MK在EG动物模型中的治疗作用及可能的机制。干预组小鼠采用MK干预治疗后，其毛发萎缩、腹泻、活动减少、虚弱等临床症状几乎得到完全缓解，体质量较模型组明显增高（P＜0.01），外周血EOS浓度、IgE和LTD4水平较模型组明显降低（P＜0.01），胃肠道黏膜组织结构几乎正常或仅有轻度损伤，故笔者认为：MK可能通过降低外周血IgE、LTD4以及EOS水平来达到治疗 EG 的目的［7］。本研究结果也显示，M1I0组SD幼鼠经OVA激发后肠道黏膜中EOS密度、MC密度及MC脱颗粒率增加，M1I1组SD幼鼠经MK干预后肠黏膜EOS密度、MC密度及MC脱颗粒率较M1I0组明显降低，说明MK干预可显著减少肠黏膜中EOS、MC浸润及MC脱颗粒。析因设计的方差分析显示：MK干预是肠黏膜EOS密度、MC密度及MC脱颗粒率改变的主要原因之一。这一结果提示，与未用MK干预治疗的造模组比较，MK干预能够明显改善EG所致的肠道形态结构损伤，抑制胃肠道炎症反应，达到治疗EG的目的，可能与MK能抑制肠黏膜局部EOS、MC浸润及MC脱颗粒有关。

综上所述，MK可能通过减少EG动物幼鼠肠黏膜EOS浸润、MC聚集及MC脱颗粒，从而改善OVA所致的肠道黏膜结构损伤，减轻肠道充血、水肿，最终抑制EG所致的肠道炎症反应，达到治疗EG的目的。因此，CysLTRA在临床治疗EG等变态反应性疾病中具有广阔的应用前景。但本次研究只基于动物模型。在临床治疗中，如何选择CysLTRA的起始剂量、长期维持剂量和疗程的长短等问题目前尚无定论，故还需要大量的临床研究加以证实及完善。

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