下调miR-21通过PDCD4抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖并抑制PI3K/Akt信号通路

慕生枝，孙要文，王国栋

（陕西省人民医院烧伤整形医学美容外科　陕西　西安　710068）

下调miR-21通过PDCD4抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖并抑制PI3K/Akt信号通路

慕生枝，孙要文，王国栋

（陕西省人民医院烧伤整形医学美容外科陕西西安710068）

目的：探讨microRNA-21（miR-21）对人增生性瘢痕成纤维细胞中程序性细胞死亡因子（PDCD4）表达和细胞增殖的影响及机制。方法：利用荧光定量PCR检测正常皮肤成纤维细胞GM0639和人增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）中miR-21的表达。构建含有PDCD4-pGC-Fu-GFP慢病毒和空载体对照慢病毒pGC-Fu-GFP感染HSF细胞。将HSF细胞按照不同处理方法分为：空白对照组、转染非特异miRNA的阴性对照组、转染miRNA-21抑制物的mir21 Inhibitor组、转染miR-21质粒的miR-21 mimic组、PDCD4-pGC-Fu-GFP组、pGC-Fu-GFP组和Ly294002组。转染后48h收集细胞，MTT检测细胞增殖情况。采用免疫荧光技术、荧光定量PCR和Western blot检测空白对照组、阴性对照组、miR-21 mimic组和miR-21 Inhibitor组细胞中PDCD4的表达以及基因和蛋白水平。采用荧光定量PCR和Western blot检测PDCD4-pGC-Fu-GFP组、pGC-Fu-GFP组和Ly294002组细胞周期相关蛋白C-MYC，CCND1以及通路相关蛋白p-Akt、JNK1的蛋白表达。结果：HSF细胞中miR-21呈现高表达。与空白对照组相比，抑制miR-21表达可以抑制HSF细胞增殖，上调PDCD4表达。过表达PDCD4可以抑制细胞增殖，下调细胞周期相关蛋白C-MYC，CCND1的表达，同时抑制通路蛋白p-Akt和JNK1的表达。结论：下调miR-21的表达能够促进PDCD4表达，抑制HSF细胞增殖以及PI3K/AKt信号通路。

microRNA-21；PDCD4；人增生性瘢痕成纤维细胞；细胞增殖；抑制；PI3K/Akt

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）常发生于创伤尤其是烧伤后，是一种病理性愈合现象，不仅影响美观而且可能导致机体功能障碍[1]。在组织学上增生性瘢痕的形成是由伤区成纤维细胞过度增殖、胶原分泌活性增强导致。瘢痕形成过程中，成纤维细胞合成并分泌大量的胶原蛋白，使细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分大量沉积在组织中[2]。目前对增生性瘢痕的预防和治疗仍面临着很多困难。虽然有许多治疗方法，但众多学者还在不断地探索更理想的防治方案[3]，但是还没有对瘢痕形成的治疗模式达成共识[4]。研究发现，一些miRNAs参与了纤维化过程中ECM的代谢调控，在心衰、间质纤维化和心肌肥厚等疾病中，成纤维细胞中miR-21的表达增加。同时miR-21的表达失调也与肺纤维化病变中的多个关键信号通路有关[5-6]。另外，有研究表明抑制 miR-21的表达能够降低博莱霉素诱导的小鼠肺部间质纤维化的病变程度[7]。然而，miR-21是否参与了增生性瘢痕组织形成的调控目前还不清楚，本研究将从miR-21对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖影响及调控机制展开研究和讨论，从而为增生性瘢痕的治疗提供实验依据。

1　材料和方法

1.1材料

正常人皮肤成纤维细胞GM0639和人增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophic scar fibroblasts，HSF），SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量PCR试剂盒购自上海生工生物试剂公司，新生牛、胎牛血清为PAA产品，Opti-MEM、RPMI1640培养基为Hyclone产品，LipofectamineTM2000脂质体购自Invitrogen公司。PDCD4多克隆抗体为Cell Signal公司产品，βactin（鼠抗）、HRP标记的抗鼠、抗兔二抗为中杉金桥公司产品，C-MYC、CCND1、p-Akt抗体均购自Cell Signaling Technology公司，JNK1购自epitomics公司。10%正常羊封闭血清购自福州硕博生物技术有限公司，免疫荧光染色二抗稀释液购自碧云天生物。Ly294002为Cayman Chemical公司产品。

1.2构建PDCD4-pGC-Fu-GFP病毒表达载体

从上海吉凯基因化学技术有限公司购买PDCD4全长克隆，应用PCR技术扩增PDCD4编码框序列，产物经过纯化、AgeⅠ酶切、酶切片段凝胶回收、连接，将其克隆到慢病毒表达载体pGC-Fu-GFP中。并且将连接产物转化为感受态细胞内表达，挑取克隆进行PCR验证。鉴定阳性者送公司测序。比对分析后，提取测序成功的克隆的质粒。

1.3细胞培养及分组

人增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）常规培养于含10%FBS胎牛血清RPMI-1640培养液中，放置37℃含5%CO2培养箱。转染前1天对细胞进行传代，使其融合度为40%的时候进行转染。根据处理方法的不同将HSF细胞分为以下几组：①空白对照组：不转染，细胞正常生长；②阴性对照组：转染非特异性siRNA作为阴性对照；③miR-21 mimic组：转染miR-21质粒；④miR-21 Inhibitor组：转染miR-21抑制物；⑤PDCD4-pGC-Fu-GFP组：感染含有PDCD4的慢病毒载体PDCD4-pGC-Fu-GFP；⑥pGC-Fu-GFP组：感染pGC-Fu-GFP空载对照慢病毒；⑦Ly294002组：终浓度为20μmol/L Ly294002处理细胞阻断PI3K/Akt通路。

1.4 MTT法检测各组细胞增殖情况

分别取上述处理后的各组细胞，按每孔1×103个细胞接种于96孔板中，每孔体积为200μl，每组细胞设置4个复孔，同时设置空白对照，各培养24 h、36h、48h和72h。每孔加入5 mg/ml的MTT 20μl，37℃培养4h后弃去培养基，加入150μl DMSO，室温避光摇床震荡10min，使结晶物充分溶解。以空白孔为对照，酶标仪490nm波长测定各孔吸光度值（OD值），OD值的大小表示细胞增殖能力的大小。各组实验重复三次取平均值。

1.5免疫荧光染色检测PDCD4表达

细胞在盖片上生长融合到95%～100%时，用1× PBS洗3次，每次10 min；4%的甲醛室温固定25 min；0.2%Triton X-100透化2～5min；5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭30min，加一抗PDCD4（用1%BSA按照1：1 000稀释）4℃过夜，1×PBS洗涤3次，每次10 min；加二抗IgG（用1%BSA按照1：1 000稀释）暗室避光30min，95%甘油封片。荧光显微镜下观察结果并拍摄图片。阳性反应为绿色荧光。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测量荧光强度并定位分析。

1.6 qRT-PCR检测miR-21、PDCD4、C-MYC和CCND1的mRNA相对表达量

各组处理后的细胞根据按照GREEN spin组织/细胞RNA快速提取试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA。按照Takara RNA PCR Kit（AMY）Ver.3.0说明书操作进行反转录。用RT试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后以cDNA的第1链作为模板进行PCR扩增。PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析、DNA吸光度扫描检测；显色条带图像分析系统（Alpha Imager 2 000）检测其积分吸光度值，与内参β-actin条带的比值为mRNA表达水平参数。正常人皮肤成纤维细胞和人增生性瘢痕成纤维细胞中检测miR-21的表达，miR-21的基因表达检测是以U6小RNA为内参。空白对照组、阴性对照组、miR-21 mimic组和miR-21 Inhibitor组检测PDCD4的mRNA表达，空白对照组、PDCD4-pGC-Fu-GFP组和pGC-Fu-GFP组检测C-MYC和CCND1的mRNA表达。所用引物均由上海生工有限公司合成。具体引物序列表1。

1.7 Western blot检测各组蛋白表达

收获各组细胞，加入裂解液提取蛋白，BCA法总蛋白定量。调整上样量为25μg总蛋白/样本，上样，电泳，转膜，封闭过夜。封闭完毕后PBST洗膜5次，分别加一抗（所用的一抗稀释比例分别为抗体PDCD4 1：2000；抗体C-MYC 1：1000；抗体CCND1 1：1000；抗体p-Akt 1：1000；抗体JNK1 1：1000），37℃反应1.5 h，PBS洗膜5次，加辣根过氧化物酶标记二抗，37℃反应1h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝胶成像系统依次显影、定影，Quantity One Basic软件分析胶片中蛋白条带。本步实验重复3次。

1.8统计学处理

所有数据采用SPSS 13.0软件处理，计量数据以均数±标准（x±s）表示，统计学分析多样本比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较釆用LSD法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

表1　所有所有检测基因具体引物序列

2　结果

2.1正常成纤维细胞和HSF中miR-21的表达检测

与人正常皮肤成纤维细胞相比，HSF细胞中miR-21的表达显著增加（P＜0.05），具有统计学意义（图1）。

2.2miR-21调控HSF细胞增殖

与空白对照组相比，miR-21 Inhibitor组中HSF细胞增殖显著受到抑制（图2），miR-21 mimic组中HSF细胞增殖显著增加，阴性对照组无明显差异。2.3 miR-21调控HSF细胞中PDCD4的表达

图1　GM0639和HSF细胞中miR-21表达量检测

与空白对照组相比，miR-21 Inhibitor组中HSF细胞内PDCD4的mRNA表达和蛋白表达显著上调（P＜0.05），免疫荧光强度显著增强。miR-21 mimic组中HSF细胞内PDCD4的mRNA表达和蛋白表达显著降低，免疫荧光强度也降低，具有统计学意义（图3），阴性对照组中无明显差异。

图2　miR-21对HSF细胞增殖的影响

2.4 PDCD4过表达抑制HSF细胞增殖

与空白对照组相比，PDCD4-pGC-Fu-GFP组中细胞增殖显著受到抑制（图4），pGC-Fu-GFP组无明显差异。

图3　miR-21对HSF细胞中PDCD4表达的影响

2.5 PDCD4过表达抑制细胞周期蛋白C-MYC和CCND1的表达

图4　过表达PDCD4对HSFb细胞增殖的影响

与空白对照组相比，PDCD4-pGC-Fu-GFP组中细胞内细胞周期蛋白C-MYC和CCND1的基因表达（P＜0.05）和蛋白表达都显著减少（图5），pGCFu-GFP组无明显差异。

2.6 PDCD4过表达抑制PI3K/Akt通路

与空白对照组相比，PDCD4-pGC-Fu-GFP组中细胞PI3K/AKt通路中相关蛋白pAKt、JNK1的蛋白表达显著减弱（图6），Ly294002组中pAKt、JNK1的蛋白表达也显著减弱，pGC-Fu-GFP组无明显差异。

3　讨论

增生性瘢痕是人体对创伤产生过度愈合反应的结果，是人体创伤、炎症、烧伤、外伤或自发的一种过度的皮肤纤维增生性疾病，以成纤维细胞增殖旺盛、细胞外基质中胶原、蛋白多糖、糖蛋白等过度沉积，胶原纤维排列紊乱为主要病理特征[3，8]。目前临床上对于增生性瘢痕还没有十分满意的治疗方案。由于成纤维细胞参与了瘢痕形成的整个过程，抑制成纤维细胞的增殖和转化对于瘢痕治疗有重要意义[9]。

图5　过表达PDCD4对HSF细胞中C-MYC和CCND1表达的影响

图6　过表达PDCD4对PI3K/AKt通路中相关蛋白表达的影响

miRNA是一种长约19-22nt的非编码RNA，在基因表达调控方面具有广泛和普遍的作用，参与调节正常生理过程及病理过程，如器官的发育、创伤的愈合以及肿瘤的发生和转移等，它几乎参与了调控细胞活动的各个环节，例如细胞增殖、分化以及凋亡[10]。已经有研究报道miR-21在心衰、间质纤维化和心肌肥厚的成纤维细胞中呈现高表达状态，同时也发现miR-21表达失调可能调控肺纤维化的几个关键信号通路[11-12]。通过上述文献可以发现miR-21是对胶原等ECM合成起促进作用的一类miRNA分子，在纤维化疾病中具有重要调控作用。在我们的研究中也证实了miR-21在HSF细胞中的表达量比正常皮肤成纤维细胞中显著增加。PDCD4是一个新发现的与细胞周期及凋亡相关的抑癌基因，同时是miR-21调控的靶基因[13]。本研究中发现，转染miR-21之后，HSF细胞中PDCD4表达显著下降，同时促进了细胞增殖。抑制miR-21表达之后，能够显著降低HSF细胞的增殖以及增加PDCD4的表达量。这表明miR-21的高表达能够促进瘢痕的形成，抑制miR-21表达能够抑制瘢痕形成，临床上可以通过基因干扰技术下调miR-21的表达来减少瘢痕的发生。

PI3K/Akt信号通路为细胞内重要信号传导通路之一，其在维持细胞的正常生理功能如生长、分化、代谢及细胞骨架重排中起着关键的作用[14]。PI3K/Akt通路已被证实广泛存在于人体的多个生理功能中，大量证据说明激活信号转导通路具有抗细胞凋亡作用，而且这一通路与增生性疾病有着紧密的联系。然而，有关在体外实验中信号转导通路与增生性瘢痕的相关性研究文献报道较少。Bao[15]等发现下调miR-21可通过抑制PI3K/Akt信号通路从而减少肝癌细胞MHCC-97H的增殖与迁移。这表明miR-21与PI3K/ Akt通路在细胞增殖中具有密切协调作用。本研究中发现下调miR-21表达之后，PDCD4表达上调。构建含有PDCD4片段的慢病毒载体感染HSF使HSF细胞过表达PDCD4基因，抑制了HSF细胞的增殖，显著减少了细胞周期蛋白C-MYC和CCND1的表达，同时降低PI3K/ Akt信号通路相关蛋白p-AKt和JNK1的表达，这与使用Ly294002阻断PI3K/Akt通路后所降低p-AKt和JNK1蛋白表达的作用一致。因此，我们推断下调miR-21之后能够上调靶基因PDCD4表达，通过抑制PI3K/Akt信号通路从而抑制HSF细胞增殖。

综上所述，在增生性瘢痕成纤维细胞中，miR-21呈现高表达，促进了细胞增殖和瘢痕的形成。通过干扰miR-21的表达之后，能够上调细胞内抑癌基因PDCD4的表达，通过抑制PI3K/Akt信号通路从而抑制细胞增殖，减少瘢痕的发生，这对于临床上应用miR-21靶向分子治疗增生性瘢痕提供了理论依据。

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编辑/张惠娟

Down-regulation of miR-21 inhibits the HSF cells proliferation and the PI3K/Akt pathways via PDCD4

MU Sheng-zhi，SUN Yao-wen，WANG Guo-dong
（Department of Burn and Plastic and Cosmetic Surgery，Shaanxi Province People's Hospital，Xi'an 710068，Shaanxi，China）

ObjectiveTo study the effect and mechanism of microRNA-21 on the expression of PDCD4 and the proliferation of HSF cells.Methods The level of miR-21 in GM0639 and HSF cells was detected with qRT-PCR.HSF cells were divided into seven groups：control group，negative control group（transfected with no-related siRNA），miR21 Inhibitor group（transfected with miRNA-21 inhibitors），miR-21 mimic group（transfected with miR-21 mimic），PDCD4-pGC-Fu-GFP group，pGCFu-GFP group and Ly294002 group.The cells proliferation was detected by MTT after the transfection with48h.TheexpressionofPDCD4geneandproteininthecellsweredetectedby immunofluorescence，Real-time PCR and Western-blot methods respectively.The expression of CMYC and CCND1 as well as p-Akt and JNK1 in the group of control，pGC-Fu-GFP and PDCD4-pGC-Fu-GFP were detected by Real-time PCR and Western blot，respectively.Results miR-21 was overexpressed in HSF cells.Compared with the group of control，down-regulation miR-21 obviously inhibited the HSF cells proliferation and induced the expression of PDCD4.PDCD4 overexpression inhibited the HSF cells proliferation and decreased the expression of C-MYC，CCND1，p-Akt and JNK1.ConclusionDown-regulation of miR-21 could induce the PDCD4 overexpression，which inhibits the HSF cells proliferation and the PI3K/Akt pathways.

microRNA-21；PDCD4；hypertrophic scar fibroblasts；cell proliferation；inhibit；PI3K/Akt

R619+.6

A

1008-6455（2015）23-0039-05

孙要文，主任医师；主要研究方向：瘢痕整形修复，创伤修复，自体脂肪移植；单位：陕西省人民医院烧伤整形医学美容外科，陕西西安友谊西路256号，邮编：710068

2015-10-21

2015-12-15