左归丸对老年大鼠CD4+T细胞IL-2基因启动子区域甲基化的影响

龚张斌 徐品初 韩志芬 金国琴 (上海中医药大学基础医学院生化教研室，上海 20203)

T细胞功能紊乱是免疫衰老过程中最显著的变化之一。衰老机体细胞免疫功能衰退，主要表现为白细胞介素(IL)-2基因表达下降，出现继发性免疫缺陷，感染性疾病、肿瘤等的罹患率和死亡率大幅升高〔1〕。研究发现在IL-2基因转录起始点附近包含有多个CpG结构，它们的甲基化水平对IL-2基因的表达具有重要调节作用〔2〕。本实验通过观察自然衰老“肾虚”大鼠模型IL-2基因启动子区域CpG位点甲基化水平的变化，探讨左归丸对IL-2转录表观遗传修饰调控的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠，清洁级，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(沪)2008-0016。饲养条件:群养，2 只/笼，温度 18℃ ～22℃，光暗周期 12 h∶12 h。采用组间比较法随机分组:① 青年对照组:6月龄;② 老年对照组:23月龄;③老年左归丸组(简称老年左归组):23月龄。老年左归组从20月龄起以饮料方式饲喂左归药液，连续3个月，各鼠用药剂量为0.5 g生药/100 g体质量，约为临床成人每千克体质量剂量的10倍。青年对照组、老年对照组给予正常饮水和饲料。

1.1.2 主要药物和试剂 左归丸:按照《景岳全书卷五十一·新方八阵》原方进行配制，熟地24 g、山药12 g、枸杞12 g、山茱萸 12 g、川牛膝9 g、菟丝子12 g、鹿角胶12 g、龟胶12 g，购自上海康桥药业有限公司。除鹿角胶、龟胶外，其余成分按原方比例水煎2次，浓缩成剂，将鹿角胶、龟胶烊化，混合此三种药液，浓缩成膏，浓度2.92 g生药/g煎膏，－30℃保存。

FITC-抗CD4，兔抗大鼠 CD3、CD28单克隆抗体等购自Ebioscience公司。DNA甲基转移酶(DNMTs)活性检测试剂盒购自Epiquik公司。PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要仪器 ABI SETPONE PLUS型荧光定量PCR仪，Applied Biosystems，Inc.;BD FACSAria型流式细胞仪，BD Biosciences公司;Biotek酶标仪，Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞仪分选CD4+T细胞 大鼠腹腔麻醉，无菌条件下取脾脏，冰上研磨得单细胞悬液，应用大鼠淋巴细胞分层液分离淋巴细胞，抗-CD4-FITC染色，4℃ 30 min，避光。应用流式细胞仪进行CD4+T细胞的分选。细胞纯度＞95%，活细胞＞90%。

1.2.2 抗CD3/抗CD28联合刺激CD4+T细胞 分选得到的细胞随机进行刺激处理或无刺激处理。刺激处理:预先以5 μg/ml抗-CD3单抗包被24孔培养板。各组CD4+T细胞用含10%(体积化)热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640溶液调整细胞密度为2×106/ml，加入24孔培养板中，同时加入200 U/ml的青霉素和 100 μg/ml的链霉素，2 μg/ml抗-CD28 单抗，置于含5%CO2、100%湿度、37℃培养箱中，进行体外刺激培养。分别在4、24 h收集细胞。无刺激处理细胞用含10%FBS，200 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI-1640溶液在同样条件下培养。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 Q Real time PCR法检测IL-2基因mRNA表达 Trizol Reagent抽提各组各时间点CD4+T细胞的总RNA。合成cDNA，采用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒，进行q RT-PCR反应。反应体系:2 ×SYBR Premix EX TaqTMⅡ10 μl，正、反义引物(10 μmol/L)各 0.8 μl，50 × ROX Reference Dye or Dye Ⅱ0.4 μl，反转录产物 2 μl，DEPC 水加至20 μl，混匀，加入 PCR 管中。扩增条件:95℃变性30 s;95℃ 5 s，61℃ 退火31 s，共40个循环;95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。每组待测样本均设立六个重复，全部反应结束之后，mRNA的变化值按公式:2-△△Ct〔△△Ct=样本△Ct－阴性对照Ct〕进行计算。引物如下:IL-2:正义 agcgtgtgttggatttgactc，反义 atgatgctttgacagatggcta;β-actin:正义:cacccgcgagtacaaccttc，反义:cccatacccaccatcacacc。

1.2.3.2 ELISA法检测CD4+T细胞DNMTs活性 按照Epiquik试剂盒说明书进行。

1.2.3.3 特异性甲基化PCR(MSP)法检测CD4+T细胞IL-2基因启动子区域各CpG位点的甲基化程度 Qiagen DNA抽提试剂盒抽提基因组DNA(gDNA)。应用GenomiPhi DNA Amplification试剂盒(Amersham Bioscience)制备阴性对照(全部CpG位点均为非甲基化)。应用CpG methyltransferase试剂盒(New England BioLab)制备阳性对照(全部CpG位点均为甲基化)。Qiagen methylation-Gold试剂盒处理gDNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变。以处理后的gDNA为模板进行q RT-PCR反应。反应体系为:2×SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ10 μl，正、反义引物(10 μmol/L)各 0.8 μl，50 ×ROX Reference Dye or DyeⅡ0.4 μl，gDNA 2 μl，DEPC 水加至20 μl，混匀，加入 PCR管中。扩增条件:95℃变性 30 s;95℃5 s，61℃ 退火 31 s，共 40 个循环;95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。每组待测样本均设立六个重复。按照以下公式进行计算:2－CtM/(2－CtM+2－CtU)×100%。引物如下:Set1甲基化正义5'-ATTTTGTGTGTAATTAGTTCGTCGT-3'，反义 5'-ACAATTTTAATTCATATAATAAACGCC-3';Set1非甲基化正义5'-ATTTTGTGTGTAATTAGTTTGTTGT-3'，反义 5'-ACAATTTTAATTCATATAATAAACACC-3'。Set2甲基化正义5'-TGTATTTGTATATATTTTATTTTTTTC-3'，反义 5'-AAATACACCAAATTCCTCG-3';Set2非甲基化正义5'-TGTATTTGTATATATTTTATTTTTTTT-3'，反义 5'-AAATACACCAAATTCCTCA-3'。β-actin正义5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，反义5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。

2 结果

2.1 各组大鼠CD4+T细胞中IL-2 mRNA的表达情况 抗-CD3联合抗-CD28刺激4 h后，IL-2 mRNA开始表达，但各组间无明显差异(P＞0.05)。抗-CD3联合抗-CD28刺激24 h后，与青年对照组比较，老年对照组CD4+T细胞IL-2 mRNA表达显著降低(P＜0.01);与老年对照组比较，老年左归组IL-2 mRNA表达显著升高(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠CD4+T细胞经刺激后IL-2 mRNA表达的变化(±s，n=6，%)

表1 各组大鼠CD4+T细胞经刺激后IL-2 mRNA表达的变化(±s，n=6，%)

与青年对照组比较:1)P＜0.01;与老年组比较:2)P＜0.05;下表同

0 h 4 h 24 h青年对照组组别1.576±0.0588.654±1.2380.664±9.74老年对照组 1.492±0.10710.488±1.3038.673±5.611)老年左归组 1.271±0.0999.898±1.5747.997±8.572)

2.2 各组大鼠CD4+T细胞中DNMTs的活性变化 与青年对照组(2.534±0.29)比较，老年对照组CD4+T细胞DNMTs活性(6.342±0.33)显著升高(P＜0.01)。与老年对照组比较，老年左归组DNMTs活性(5.633±0.12)明显降低(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠CD4+T细胞刺激后IL-2启动子区域CpG位点的甲基化程度变化 见表2。抗-CD3联合抗-CD28刺激24 h后，IL-2基因转录起始位点(TSS)上游Set1区域:与青年对照组比较，老年对照组CpG位点甲基化程度显著升高(P＜0.01);与老年对照组比较，老年左归组CpG位点甲基化程度明显降低(P＜0.05)。Set2区域:各组间CpG位点甲基化水平均无统计学差异(P＞0.05)。

表2 各组大鼠CD4+T细胞刺激24 h后IL-2启动子CpG位点甲基化水平的变化(±s，n=6，%)

表2 各组大鼠CD4+T细胞刺激24 h后IL-2启动子CpG位点甲基化水平的变化(±s，n=6，%)

甲基化水平青年对照组组别 Set1甲基化水平 Set226.795±5.4294.277±3.82老年对照组 61.488±5.101) 93.533±3.65老年左归组 54.625±4.472)93.755±4.09

3 讨论

IL-2是调控CD4+T细胞分化平衡状态的关键因子之一。本实验结果显示，IL-2基因的转录水平呈现增龄性下降的特征，与其他报道一致〔3〕。

IL-2仅在活化的T细胞中表达，揭示其转录受到表观遗传修饰的调控〔4〕。表观遗传修饰包括DNA甲基化，染色质重塑，组蛋白修饰，microRNA调控等多种机制，其中DNA甲基化研究较为深入〔5〕。IL-2基因转录起始点附近+98～－2.2 kb区间包含多个CpG结构，其甲基化水平直接决定IL-2基因的表达与否〔6〕。DNMTs促进CpG甲基化，有实验发现，如果应用甲基化酶抑制剂处理T细胞，IL-2分泌增多〔7〕。而应用抗CD3/抗CD28共刺激后发现多个CpG位点出现去甲基化，进而激活IL-2基因转录〔8〕。我们应用methprimer软件对IL-2启动子区域进行甲基化引物的设计，将该启动子区分为两个区域(Set1，Set2)，其中 Set1区域包括 TSS上游四个 CpG(－306，－434，－544，－547)位点，Set2包括 TSS上游两个 CpG(－995，－1263)位点。实验发现，在未刺激时，Set1，Set2区域的CpG位点均呈现高度甲基化，此时IL-2基因表达沉默。当CD4+T细胞受anti-CD3/anti-CD28刺激24 h后，Set1区域CpG位点甲基化程度明显降低，导致IL-2基因转录活化。本研究显示T细胞被激活后，DNA相应CpG位点发生去甲基化过程，使IL-2基因表达开放，以上结果提示:衰老过程中，基因启动子区域特定CpG位点甲基化程度的增高或者去甲基化水平的降低，是导致老年大鼠IL-2基因转录水平下降的原因之一。

中医“肾”的功能、阴阳平衡学说与衰老以及免疫调控之间关系密切〔9〕。机体在衰老进程中受体内外各种致病因素刺激，如果阴阳持续失衡，则加重疾病进展。肾寓真阴真阳，与人的生、长、壮、老、已关系密切。机体随衰老肾气不足、阴阳失调，免疫稳态失衡，最终导致阴阳离决，直至死亡。由此可见，阴阳虚损失衡是衰老的重要病机。根据此理论，张景岳所创左归丸，重用熟地滋补真阴，为君药，大量补阴药中，少佐补阳之品，取其“阳中求阴”之义，阴阳并调，奏滋阴补肾，填精益髓之效，为补肾之阴阳的经典方剂〔10〕。本实验发现，老年大鼠饮用左归丸后，DNMTs活性减弱，Set1区域CpG位点甲基化程度下降，进而导致IL-2转录升高，延缓了细胞免疫功能退化的进程。

免疫调节是一种整体调节，免疫稳态的失衡是许多疾病发生发展的病理基础，与阴阳的消长特性颇有类似之处。阴平阳秘是机体的自稳状态，阴阳平衡是生命过程中系统稳态和动态的统一。左归丸阴阳双调的治法具有双向、多靶点调节的特点〔10〕，在全方位调节衰老机体免疫内环境的平衡方面具有一定优势，值得深入研究。

1 Thomas R.Malek.The biology of Interleukin-2〔J〕.Annu Rev Immunol，2008;26(2):453-79.

2 Crispín JC，Tsokos GC.Transcriptional regulation of IL-2 in health and autoimmunity〔J〕.Autoimmun Rev，2009;8(3):190-5.

3 Pioli C，Pucci C，Barile S，et al.Role of mRNA stability in the different patterns of cytokine production by CD4+cells from young and old mice〔J〕.Immunology，1998;94(3):380-7.

4 Adachi S，Rothenberg EV.Cell-type-specific epigenetic marking of the IL2 gene at a distal cis-regulatory region in competent，nontranscribing T-cells〔J〕.Nucleic Acids Res，2005;33(10):3200-10.

5 Wilson CB，Makar KW，Shnyreva M，et al.DNA methylation and the expanding epigenetics of T cell lineage commitment〔J〕.Semin Immunol，2005;17(1):105-19.

6 Shi L，Qiu DM，Zhao GH，et al.Dynamic binding of Ku80，Ku70 and NF90 to the IL-2 promoter in vivo in activated T-cells〔J〕.Nuc Acids Res，2007;35(7):2302-10.

7 Murayama A，Sakura K，Nakama M，et al.A specific CpG site demethylation in the human interleukin 2 gene promoter is an epigenetic memory〔J〕.EMBO J，2006;25(5):1081-92.

8 Rajan M，Thomas，Ling Gao，et al.Signals from CD28 induce stable epigenetic modification of the IL-2 promoter〔J〕.J Immunol，2005;1747:4639-46.

9 龚张斌，姚建平，金国琴.补肾方药对老年大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质所属组织结构形态变化的影响〔J〕.辽宁中医杂志，2006;33(1):103-4.

10 龚张斌，徐品初，金国琴.左归丸对大鼠凋亡胸腺细胞Bcl-2，Bax表达影响的研究〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(22):3290-2.