DNA分子复制过程中的引物相关知识补充

刘学廷

摘 要 DNA分子复制需要引物，体内DNA分子复制需要RNA作为引物，复制结束后将引物切除，并通过相关酶补齐引物切除后留下的空隙；DNA体外扩增时需要DNA引物，复制结束时不需要切除引物，但对DNA引物设计和合成提出了较高的要求。

关键词 RNA引物 DNA引物 引物切除 引物设计

中图分类号 Q-49 文献标志码 E

近几年，有关“引物”的题目频繁地出现在各地调研题和高考题中，而现有高中生物教材中只提及PCR需要引物，而引物是什么？引物从哪儿来？引物的作用是什么？为什么需要引物？是否所有DNA复制都需要引物？如何切除引物？……这些相关知识在教材中并没有提及。为了对“引物”有较全面的了解，下面参考有关资料，对引物相关知识作概括和补充。

1 引物的涵义

DNA分子复制不能从头开始，必须从一段已经存在的核苷酸链上延伸，这一段核苷酸序列就是引物，又称“引子”。在生物体内，DNA分子复制所需引物主要是一小段RNA分子，但如果在体外进行DNA扩增，引物一般是一小段人工合成的DNA分子。

DNA每一次复制时一般需要两个引物，一个引物与DNA一条DNA模板链一端互补，另一个引物与另一条DNA模板链的另一端互补。

少数DNA分子复制时不需要引物，某些病毒如M13噬菌体内的DNA为单链环状DNA分子，可通过滚环方式进行复制：M13噬菌体进入大肠杆菌后，先形成复制型双链环状DNA分子，然后在M13噬菌体的双链DNA环状分子一条链（正链）上切一个切口，产生游离的3′-羟基作为延伸起点，最后在宿主细胞DNA聚合酶III的催化下，以另一条单链即负链为模板不断地合成新的正链（图1）。此过程不需要新的引物，直接以原有正链的切口处3′-羟基为引物连接上新的脱氧核苷酸。

2 DNA分子复制时需要（RNA）引物的原因

无论体内还是体外，DNA的复制均需要DNA聚合酶，但DNA聚合酶必须从一小段已存在的核酸（DNA或RNA）开始，把新的核苷酸添加到该段核酸的3′-OH上，也就是说DNA聚合酶只能延长一段核酸链的3′端，而引物就提供了这段核酸链的3′-OH，所以DNA分子复制时需要引物。

大多数DNA分子复制时引物为什么是一小段RNA而不是DNA，这主要与DNA分子复制具有高度的忠实性有关：在DNA分子复制刚刚开始的时候，最初加入的核苷酸难以与模板形成稳定的双螺旋结构，导致碱基很容易发生错配，从而产生变异，而DNA原有的校正系统难以识别这一小段核苷酸序列，这不利于DNA分子的稳定性。但如果用RNA做为引物，即使出现差错也不要紧，因为DNA聚合酶可识别这些异常的核苷酸序列并将引物切除，从而保证了DNA分子结构的稳定性。另外，RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA不需要引物，所以在体内合成RNA引物比DNA引物更容易。

若在体外进行DNA分子扩增，则以一对已知序列的DNA片段作为引物。一个标准的PCR反应系统包括：DNA模板、耐热的DNA聚合酶（如Taq酶）、一对引物、4种dNTP、合适的Mg2+和一定体积的缓冲液等。由于PCR反应系统不能切除RNA引物，这不利于DNA分子结构的稳定。而体内DNA复制时，有专门的酶将RNA引物切除。另外，体外DNA复制所需引物需人工合成，无论是序列的测定还是合成，DNA片段较RNA片段更容易。

3 复制后“引物”的切除与补齐

DNA分子体内复制所需引物主要是一小段RNA，RNA引物只是启动DNA复制，但在复制结束后，引物必须切除，否则混杂RNA片段的DNA分子影响其结构的稳定，也影响遗传信息的传递与表达。在原核细胞内，切除RNA引物的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H，其中DNA聚合酶I既有5′→3′方向延伸脱氧核苷酸链功能，还具有5′→3/和3′→5/外切核酸酶的活性，所以DNA聚合酶I凭借5’-外切酶的活性切除总是位于5′端的RNA引物。核糖核酸酶H是一种特殊的内切核酸酶，专门水解与DNA杂交的RNA，包括RNA引物，如T4噬菌体DNA复制中引物的切除，也可通过宿主细胞的DNA聚合酶I切除。而真核细胞的任何一种DNA聚合酶均没有5/-外切酶活性，因此负责切除RNA引物的酶主要是核糖核酸酶H。切除后的DNA片段由DNA连接酶连接在一起形成连续的DNA链。如果是体外DNA复制，由于引物是DNA片段，所以不需要切除引物。

当真核细胞的线型DNA复制到最后，位于末端的RNA引物被切除后，会留下一段空隙得不到补充，长期下去，末端DNA就会越来越短。因此必须填补末端RNA引物被切除后留下的空隙，这个过程主要靠端聚酶来完成，端聚酶由蛋白质和RNA两种成分组成，其中蛋白质具有反转录酶的活性。具体过程如下：首先是以端聚酶中的RNA为模板，在端聚酶中的反转录酶的作用下，合成DNA片段，从而延伸线型DNA一条链的3′端，然后再以延伸的DNA片段为模板，合成新的冈崎片段，最终填补RNA引物被切除后留下的空隙（图2）。

如果是其他类型的线型DNA，如某些噬菌体的线型DNA、某些真核细胞病毒的线型DNA等，它们的引物被切除后留下的空隙可通过将线型DNA暂时转变为环形DNA，或通过滚环复制等方式解决。

4 “引物”的设计

体内DNA复制所用引物一般为RNA片段，在复制结束后被切除，而体外扩增DNA使用的是DNA引物，在DNA扩增结束后不被切除，这就对引物有了极高的要求。

在体外合成DNA引物时要注意以下几点：① 引物的长度一般为15～30 bp（碱基对），其有效长度（是指与模板配对的引物长度，不包括5′末端添加的序列）一般不大于38 bp，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）的最佳作用温度（74度），从而降低产物的特异性。当然引物的长度也不能过短，否则会增加错配现象。② G和C的含量应在40%～60%之间，引物G和C的含量过低，会导致PCR过程中退火温度较低，不利于提高PCR的特异性，但G和C的含量过高也易于引发非特异扩增。③ 引物碱基尽可能随机分布，应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3′端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。另外，引物上游和下游引物的G和C的含量最好相近，不能相差太大。④ 引物自身不能含有互补序列，否则会形成发夹样二级结构，导致引物不能和模板结合。两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体。⑤ 引物3′端最后一个碱基应严格与模板互补配对，否则影响PCR扩增效率。⑥ 引物3′端最后一个碱基应选在密码子的第一个或第二个核苷酸上。由于碱基摆动，大多数密码子具有简并性，编码同一个氨基酸的密码子第三个碱基可以有差异。⑦ 引物3′端最后一个碱基最好选择G或C，不选A。有资料表明，当末位为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成，而末位为A时，错配时引发率大大降低，而当末位碱基为T时，错配的情况下也能引发的合成，当末位碱基为G、C时错配的引发率居中。因此，应尽量避免引物3′端的第一位碱基是A，引物3′端最佳碱基的选择是G和C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。

参考文献：

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