不同海拔高度酿酒葡萄1a生枝条总酚和白藜芦醇含量的差异

刘 伟 ，刘 旭 ，张 鸿 ，钟 奇 ，罗来友

（1.四川省农业科学院园艺研究所，四川 成都 610066；2.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；3.四川省农业科学院植物保护研究所，四川 成都 610066；4.甘孜州康定红葡萄酒业有限公司，四川 丹巴 626300）

葡萄是多年生藤本植物，为了提高产量和品质，每年夏季葡萄进入旺盛生长期、冬季进入休眠期时都要对枝蔓进行修剪，除极少数留作繁殖苗木外，大部分枝条（60%～70%）都被废弃，造成了极大的资源浪费。但同时葡萄枝条中富含白藜芦醇和酚类物质，研究发现[1]葡萄枝条中含有反式白藜芦醇和葡萄素，Erkan[2]等亦报道葡萄枝条中含有白藜芦醇和阿魏酸。白藜芦醇和酚类物质有很大的商业价值，对于中国乃至世界葡萄行业来说对其1a生枝条进行回收利用有很大的必要性。

研究表明[3]葡萄废弃物中含有大量以植物多酚为主的生物活性物质由40多种化学成分组成，具有抗氧化、促进肠胃消化、降低血脂肪；还能利尿、降血压、抑制细菌与癌细胞生长，及帮助消化[4-5]。

白藜芦醇又称芪三酚，是非黄酮类的多酚化合物，白藜芦醇是植物遭受紫外线照射、机械损伤等外界条件影响时合成的，是植物体在逆境时分泌的一种抗毒素[6]。1997 年 Jang[7]等在《SCIENCE》杂志上发表论文证明白藜芦醇能有效抑制与癌症各过程相关的细胞活动。作为抗氧化剂、抗突变剂和抗炎剂，白藜芦醇显示出对癌症的化学预防能力，能够防止细胞癌病变，并通过阻止激酶功能而起抗突变作用。

许多研究已证实紫外线对葡萄中白藜芦醇的合成具有诱导作用。Langcake P[8]研究发现，紫外线波长在白藜芦醇的诱导过程中十分重要，1，2-二苯乙烯合成酶（Stilbene synthase，STS）对紫外线的感受区在260～270nm。Cantos E等[9]研究了不同的紫外线强度（IW）、辐射时间（IT）、辐射距离（ID）、处理时间（Dm）对葡萄中白藜芦醇的影响。结果表明：IW=510W、IT=30s、ID=40cm、Dm=3d可以使葡萄中的白藜芦醇提高11倍；李景明[10]研究也发现不同的紫外剂量对葡萄中的白藜芦醇含量有很大的影响。在不同海拔地区，由于海拔高度的差异，紫外线强度的大小也不一样，加之环境温度、时间等的差异，会导致不同海拔地区葡萄1a生枝条中白藜芦醇含量的差异。

目前对白藜芦醇和其他多酚类物质的提取主要是从皮渣、葡萄籽中提取，而对废弃物更多的葡萄枝条则研究较少。本试验主要研究横断山区的葡萄1a生枝条的再利用，针对横断山区地势起伏明显的特点，研究对比不同品种不同海拔条件下总酚和白藜芦醇的含量差异。

1 试验材料与方法

1.1 试验地概况

试验材料（赤霞珠和美乐的1a生枝条）均采自四川省阿坝州茂县和甘孜州丹巴县，两地气象资料如表1。

两地的降雨主要集中在7～9月，而在葡萄成熟期降雨较少，同时两地区的年最低温度不低于-8℃，冬季葡萄树不需要埋土防寒，有利于葡萄的生长。茂县和丹巴除了最热月均温上很相近，其他各项指标差别都比较大。尤其是年降雨量和活动积温，差值分别为92mm和498℃。由于这些气候因子的不同，所以两地区的1a生枝条酚类物质和白藜芦醇的含量可能存在较大差异，这也是本研究的出发点。

表1 丹巴和茂县地区的气象资料

1.2 试验材料与仪器

试验材料为不同海拔高度的赤霞珠和美乐的1a生枝条，枝条采收为2012年10月10日-2012年10月15日。其中赤霞珠1a生枝条6个样品，美乐1a生枝条4个样品，如表2。

表2 试验地海拔条件

试验仪器包括紫外分光光度计（UV-2450，日本岛津）高效液相色谱仪（LC-2010AHT），超声波清洗仪（KH-500DE，昆山禾创超声仪器有限公司），旋转蒸发器（RE-52A，上海亚荣生化仪器厂），电热恒温水浴锅（HW.SY21-K，北京市长风仪器仪表公司），葡萄枝条粉碎机1台，离心机1台，石英比色皿1套。

主要试剂：酸化甲醇 1mol/L（1500mL）、20%碳酸钠溶液（1000mL）、20%乙醇（1000mL）。

1.3 测试指标与方法

1.3.1 样品预处理

将葡萄枝条用剪刀简短至1cm左右，将剪短的枝条用粉碎机粉碎，并过0.5mm筛，将粉碎的葡萄枝条粉末放于自封袋-20℃贮藏，直至提取。

1.3.2 样地土壤性质测定

有机质采用冲铬酸钾容量法-外加热法；pH值采用pH计1:2.5水土比电位法测定；速效氮采用1.0M KCl浸提、AA3连续流动分析仪测定；速效磷采用0.5M NaOH浸提、硫酸钼锑抗比色法；速效钾采用1.0M NH4OAc浸提、火焰光度法

1.3.3 总酚的测定方法

（1）标准曲线制作。用 10mL乙醇溶解0.5000g没食子酸，定容至100mL，分别移取0、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0mL 到 100mL 容量瓶中，用水定容。从上述不同浓度的标准溶液中分别移取1.0mL到100mL容量瓶中，再分别加入60mL去离子水，混合；加入5mL Folin-Ciocalteu试剂，混合；在0.5～8min内，加入15mL20%碳酸钠溶液，混合，定容。将上述标准溶液在20℃下放置2h后，在765nm波长下测定吸光值。以没食子酸为标准溶液，所得标准曲线为y=1.0069x-0.0141，决定系数R2为0.993，标准曲线见图1。

图1 酚类物质总含量测定中没食子酸的标准曲线

（2）上清液提取。称取粉末1.5g置于50ml离心管中，加入10mL甲醇，用超声波处理10min，再用旋涡震荡器震荡15min，频率为100Hz。在离心机中以9000r/min在4℃下离心10min，重复提取2次。

（3）总酚测定。取上述上清液1mL，定容至10mL。取1mL，按上述标准曲线测定方法，测定其吸光值。

（4）总酚含量计算。总酚含量（以没食子酸GAE 相当值表示）=C×V×n/M×100%，其中：C—没食子酸浓度（mg/mL）；V—溶液体积（mL）；n—稀释倍数；M—取样量（mg）。

1.3.4 白藜芦醇的测定方法

（1）上清液提取。称取5.0g粉末于50mL离心管中，加入30mL酸化甲醇，摇床下20℃（水浴）振荡提取1h，然后在离心机中以8000r/min，4℃下离心15min，重复提取3次，合并上清液与长颈烧瓶中，35℃减压浓缩至10mL，过0.22um尼龙滤膜，-20℃保存分析。

（2）白藜芦醇的测定（液相色谱法）。在室温下将样品注入到Shim-PackVP-ODSC18柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为3%的醋酸A和乙腈B，洗脱梯度：B:0.00～5.00min为 0～8.5%；5.00～16.50min为8.5%～2.0%；16.50～35.00min为2.0%～18%；35.00～50.00min为 18%～20%；50.00～65.00min为 20%～30%；65.00～70.00min为 30%～0%。流速为0.8mL/min，检测波长为200～400nm，柱温为30℃，进样量2uL。

2 结果与分析

2.1 样地土壤理化性质

不同样地土壤理化性质如表3所示。由表3可见：在不同海拔地区，pH值相差比较小，且土壤都呈弱碱性。而有机质含量变化比较大，范围在16.72～76.48g/kg，说明不同地区土壤中成分差异比较大。其中水溶性Ca变化差异也比较大，范围在100.94～851.03mg/kg，但是除了海拔1600m和2600m两地区水溶性Ca含量特别高外，其他地区变化不是特别大。另外速效钾的差别也比较大，变化范围在45.48～416.97mg/kg，变化也特别大。各地区的有机质含量的巨大差异，也使得在不同地区葡萄1a生枝条中酚类物质含量的差异。

表3 样地土壤基本理化性质

2.2 不同海拔赤霞珠1a生枝条白藜芦醇及总酚含量差异

从图2可以看出：赤霞珠1a生枝条中酚类物质总含量随着海拔高度的不断增加呈现先增加后降低的趋势。当海拔高度为2280m时，酚类物质总含量达到最大值，为2.254mg/g；当海拔高度为1700m时，酚类物质总含量最小，为0.7128mg/g。当海拔高度低于2280m时，随着海拔高度不断增加，紫外线的照射不断增强，温度逐渐降低（海拔每上升100m，温度降低0.6℃）[11]，本文分析认为：在此区间内，温度对葡萄枝条中酚类物质的影响可能小于紫外线的影响，随着海拔高度增加，紫外线加强，利于葡萄1a生枝条中酚类物质的合成。当海拔高度高于2280m时，虽然紫外线强度持续增加，但是环境温度不断降低，影响葡萄枝条的光合作用，使得葡萄1a生枝条中酚类物质合成受阻，导致其含量减少。

图2 不同海拔赤霞珠1a生枝条美乐酚类物质及白藜芦醇含量的差异

不同海拔地区枝条中白藜芦醇含量如图2。在茂县地区（图2中1700～2100m），随着海拔高度的不断增加，赤霞珠1a生枝条中白藜芦醇含量逐渐降低，当海拔为1700m时，白藜芦醇含量达到最大值0.206mg/g；当海拔为2100m时，白藜芦醇含量达到最小值0.116mg/g。在丹巴地区（图2中2280～2600m），随着海拔高度的不断增加，赤霞珠1a生枝条中白藜芦醇含量也不断降低，当海拔为2280m时，白藜芦醇含量达到最大值0.190mg/g；当海拔为2600m时，白藜芦醇含量达到最小值0.052mg/g。

2.3 不同海拔美乐1a生枝条白藜芦醇及总酚含量差异

不同海拔地区美乐1a生枝条酚类物质和白藜芦醇含量如图3。美乐1a生枝条酚类物质总含量随着海拔高度的不断增加而不断增加，当海拔高度达到最大值2390m时，酚类物质总含量最大，为1.246mg/g。当海拔高度不断增加时，环境温度在降低，紫外线强度不断增加。分析认为在此海拔区间内，紫外线对美乐1a生枝条的影响大于温度对美乐1a生枝条的影响，使得葡萄枝条能正常的光合作用，美乐1a生枝条中酚类含量也不断增加。对比图2和图3，当海拔高度为2280m时，赤霞珠1a生枝条酚类物质总含量为2.254mg/g，美乐1a生枝条酚类物质总含量为1.174mg/g；当海拔高度为2390m时，赤霞珠1a生枝条酚类物质含量为1.903mg/g，美乐1a生枝条酚类物质含量为1.246mg/g。由此可得出，在此海拔区间内，相同海拔地区的不同葡萄品种1a生枝条酚类物质含量不同，且赤霞珠1a生枝条酚类物质总含量大于美乐1a生枝条酚类物质总含量。

图3 不同海拔美乐1a生枝条酚类物质及白藜芦醇含量的差异

随着海拔高度的不断增加，美乐1a生葡萄枝条中白藜芦醇含量也逐渐增加，当海拔为1600m时，白藜芦醇含量为最小值0.064mg/g，当海拔为2390m时，白藜芦醇含量达到最大值1.078mg/g。通过与图2中赤霞珠白藜芦醇含量的比较，当海拔为1700m时，赤霞珠和美乐1a生枝条中白藜芦醇很接近；当海拔2000m时，美乐1a生枝条中白藜芦醇含量明显高于赤霞珠1a生枝条中白藜芦醇的含量。

3 结论与讨论

通过一定的方法对葡萄枝条中的白藜芦醇和酚类物质进行有效提取，大大提高了枝条的回收利用价值，对1a生葡萄枝条的回收不仅能够减少葡萄枝条的浪费和所带来的环境污染，还可以通过有效物质提取增加葡萄种植户的收入，提高其种植葡萄的积极性。本试验是以2013年采自四川茂县和丹巴不同海拔地区的赤霞珠1a生枝条和美乐1a生枝条为原料。通过对不同海拔地区的不同品种1a生枝条中酚类物质总含量和白藜芦醇含量的测定，初步得出以下结论：

多酚类物质是植物中化学物质的总称，因具有多个酚基团而得名，对人体的健康有着重要的作用。研究表明[2]：葡萄皮中酚类物质和白藜芦醇含量分别在0.1～1.7mg/g和0.08～0.39mg/g之间。本研究表明：对于美乐葡萄品种而言，1a生枝条总酚含量随着海拔高度的增加而逐渐增加；对于赤霞珠品种，1a生枝条中酚类物质的总含量随着海拔高度的逐渐增加呈现出先增加后减少的趋势，当海拔高度低于2280m时，1a生枝条总酚含量逐渐增加，在海拔高度2280m时达到最大值，当海拔高度高于2280m时，1a生枝条总酚含量逐渐降低。本文认为，随着海拔高度的不断增加，紫外线强度也在不断增加，有利于酚类物质的合成。但是当海拔达到一定高度时，可能是温度或者其它因子对葡萄枝条的影响更强，掩盖了部分紫外线对葡萄枝条的影响，再加上温度较低，光合作用也变弱，使得酚类物质的合成受阻，所以海拔进一步升高酚类物质含量较低。

对美乐1a生枝条而言，白藜芦醇含量随海拔不断升高而增加，分析认为在此海拔范围内，紫外线的强度不断增加，而且紫外线的作用明显高于温度等其它气候因子的作用，使得白藜芦醇含量和海拔高度成正相关。对赤霞珠1a生枝条而言，在茂县地区和丹巴地区1a生枝条中白藜芦醇含量都随海拔高度增加而减少。分析认为虽然随着海拔升高紫外线强度不断增加，但是温度等其它因子的作用强于紫外线的作用，光合作用也比较低，导致枝条中白藜芦醇含量的逐渐降低。

另外，在相同海拔地区，不同品种间白藜芦醇含量不同，总体上美乐1a生枝条高于赤霞珠1a生枝条。

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