Dectin-1和TLR4在烟曲霉菌性角膜炎大鼠角膜组织中的表达及其在角膜炎发病中的作用

任　毅，甘胜伟,李平华

(重庆医科大学附属第一医院眼科，重庆400016)

Dectin-1和TLR4在烟曲霉菌性角膜炎大鼠角膜组织中的表达及其在角膜炎发病中的作用

任毅，甘胜伟,李平华

(重庆医科大学附属第一医院眼科，重庆400016)

目的：探讨烟曲霉菌感染大鼠角膜后Dectin-1和Toll样受体-4(TLR4)表达及炎症因子的分泌特点，阐明其在大鼠角膜炎发病中的作用。方法：40只SD大鼠随机分为对照组(n=10)和烟曲霉菌性角膜炎组(n=30)，对照组不予任何干预，烟曲霉菌性角膜炎组给予双眼烟曲霉菌感染造模，分别于感染12 h(n=10，12 h组)、24 h(n=10，24 h组)和48 h(n=10，48 h组)后取角膜组织，ELISA法检测IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10和NF-κB水平，免疫组织化学法、RT-PCR法及Western blotting法测定角膜组织中Dectin-1和TLR4 mRNA及蛋白表达。结果：大鼠造模均成功，眼角膜裂隙灯检测观察可见对照组眼睛清澈，感染烟曲霉菌后，12 h组眼睛表面有明显的一层薄膜，薄膜与健康的角膜边界清晰；24 h组可见眼部有一层白色的浸润灶形成，且表面粗糙；48 h组角膜白色浸润灶进一步加深，且范围明显扩大，基本覆盖了整个眼球。烟曲霉菌感染后，12 h组、24 h组和48 h组角膜组织中炎症因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB水平明显高于空白对照组(P<0.05)，其中24 h组和48 h组明显高于12 h组(P<0.05)，48 h组明显高于24 h组(P<0.05)；免疫组织化学检测，大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4表达水平随着感染时间的增加逐渐增加，RT-PCR法和Western blotting法检测，大鼠眼角膜组织烟曲霉菌性角膜炎组(12 h组、24 h组和48 h组)Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)，其中24 h组和48 h组明显高于12 h组(P<0.05)，48 h组明显高于24 h组(P<0.05)。结论：Dectin-1和TLR4在受到烟曲霉菌感染后可过量分泌，进而造成大鼠炎性相关因子表达，最终促使角膜炎的发生。

真菌性角膜炎；烟曲霉菌；模式识别受体-1；Toll样受体-4

真菌性角膜炎(fungal keratitis)是困扰医学界的一个难题[1]，该病发病急，治疗难度大，属于严重致盲性眼病的一种。既往的研究[2]表明：真菌性角膜炎不易康复可能与免疫损伤密切相关，Dectin-1和Toll样受体-4(Toll-like receptor,TLR4)是介导免疫反应的2个重要因子，同时也是促炎性因子，Chai 等[3]曾发现Dectin-1和TLR4在眼角膜中有一定的表达；Leal等[4]指出：Dectin-1和TLR4促进角膜炎的发生可能与刺激中性粒细胞表达有关。但关于上述2种蛋白表达的定量分析国内外还没有文献报道。本实验通过检测Dectin-1和TLR4在大鼠烟曲霉菌性角膜炎各病程角膜组织中的表达，阐明Dectin-1和TLR4在大鼠角膜炎发病中的作用，为真菌性角膜炎治疗提供一定的参考。

1　材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器健康SD大鼠40只，雄雌各半，体质量300～400 g，购于重庆医科大学实验动物中心，动物合格证号：SYXK渝2007-0001，造模前所有大鼠均用眼科裂隙灯检查无相关眼部疾病感染；IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB试剂盒购于德国Roche Diagnostics GmbH公司,多克隆抗体Dectin-1和TLR4、单克隆抗体β-actin购于美国Santa Cruz公司，相应二抗购于金斯瑞生物科技有限公司，ECL发光试剂盒购于江苏碧云天生物有限公司，总RNA提取试剂盒购自北京天根公司，引物购于南京金斯瑞生物科技有限公司，SYBR Green通用型qPCR Master Mix 购自瑞士Roche生物；Real-time PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2标准菌株烟曲霉菌(Aspergillusfumigutus，AF)标准菌种购于中国医学科学院微生物研究所，低温保存，实验前解冻，接种到含有一定量的沙堡弱葡萄糖琼脂培养基斜面上，培养时控制温度为25℃，培养6～9 d后取出，用消毒后的生理盐水反复吹打斜面，吸出，血细胞计数板计数孢子，制成孢子浓度为108CFU·mL-1的菌悬液，振荡混匀。

1.3大鼠分组及模型的建立40只SD大鼠，随机分为对照组和烟曲霉菌性角膜炎组，对照组(n=10,全程不予任何干预)，烟曲霉菌性角膜炎组分为感染12 h组(n=10，12 h 组)、24 h组(n=10，24 h组)和48 h组(n=10，48 h组)，所有大鼠在实验前3 d给予氯霉素眼液点双眼，每天4次；实验时用1%的戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠(1 mL/100 g体质量)，大鼠及实验操作人员常规消毒后开始眼科造模手术，眼科造模手术全程在显微镜下进行。用4 mm环钻在角膜中央进行定位，之后用无菌手术刀刮除角膜中央4 mm左右的上皮层，上述步骤完成后汲取菌悬液20滴，滴在刮除上皮的角膜面，盖上角膜接触镜(由重庆医科大学医院眼科实验室自制，使用Parafilm M 封口膜模压制)。对照组给予同样量的无菌生理盐水滴入，最后进行睑裂缝合。分别于12、24和48 h后打开睑裂，照相后取出全眼角膜，行后续相关实验。

1.4ELASA法检测大鼠角膜中相关炎性因子表达从超低温冰箱中取出角膜病灶区组织5 mg，加入50 μL组织蛋白裂解液，超声细胞破碎仪破碎细胞(300 W)，电子匀浆机匀浆后，离心提取上述上清液以BCA法定量，定量后采用相应试剂盒测定IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB水平。

1.5免疫组织化学染色免疫组织化学染色参照PV9000二步法免疫组织化学试剂盒说明书。工作浓度配好后，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜观察，以图片中褐色颗粒数量和颜色程度判断其表达水平。

1.6RT-PCR法检测检测大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4 mRNA表达水平称取15 mg角膜病灶区组织，总RNA提取试剂盒提取总RNA，总RNA定量，定量后每个样本取2 μg行逆转录cDNA；逆转出的cDNA用试剂盒提供的相应预混液行PCR反应，扩增次数为36次，扩增条件按照引物说明书进行；扩增出DNA片段行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照采集数据，Image J软件计算荧光强度值，用β-actin作内参，每组实验重复3次。β-actin引物设计：上游引物，5′-GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3′；下游引物，5′-ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3′；产物长度123 bp。Dectin-1引物设计：Primer A，5′-CGTATCGGGGTATTCGGAGA-3′，Primer B，5′-CCATGCTAGGTGATGCTAGG-3′；产物长度343 bp。TLR4引物设计：上游引物，5′-CGTATACGACGAGTTCCAGT-3′；下游引物，5′-GGACTTGTTGGACGTCGAGA-3′；产物长度356 bp。以相应蛋白荧光强度值/β-actin荧光强度值的比值作为Dectin-1和TLR4 mRNA相对表达水平。

1.7Western blotting法检测大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4蛋白表达水平取出眼角膜病灶区组织10 mg，加入100 μL组织蛋白裂解液，用超声细胞破碎仪破碎细胞(300 W)，电子匀浆机匀浆后，离心提取上述上清液，并用BCA法测定蛋白含量，在定量后取样本40 μg进行SDS-PAGE蛋白电泳，电泳结束后半干转移至PVDF膜，PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭2 h后，加入一抗过夜，第2天洗膜3次，之后加入相应二抗，最后洗膜3次，暗室内ECL曝光洗片，扫描仪扫描胶片后用Image J软件计算灰度值，以β-actin作为内参，每组实验重复3次。以相应蛋白灰度值/β-actin灰度值的比值作为蛋白表达水平。

2　结　果

2.1眼科裂隙灯观察模型建立处死大鼠前，用眼科裂隙灯观察大鼠角膜：对照组大鼠眼球清澈，无真菌感染发生，12 h组眼球表面有明显的一层薄膜，薄膜与健康角膜边界清晰；24 h组可见整个眼部均有一层白色浸润灶形成，且表面粗糙，眼球上方可见明显血丝；48 h组角膜白色浸润灶进一步加深，且范围明显扩大，基本覆盖了整个眼球。上述结果提示成功建立大鼠模型。见图1(插页三)。

2.2ELISA法测定眼角膜组织中炎性因子表达水平12 h组、24 h组和48 h组IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB表达水平明显高于对照组(P<0.05)，随着时间的延长，上述5个指标均呈逐步升高的趋势，其中24 h组和48 h组明显高于12 h组(P<0.05)，48 h组明显高于24 h组(P<0.05)。见表1。

2.3免疫组织化学染色观察大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4蛋白表达及菌丝12 h组、24 h组和48 h组大鼠角膜组织中褐色颗粒数量和颜色呈逐步增加的趋势；此外，相关角膜最外围可见一层菌丝生长，进一步提示造模成功。见图2(插页三)。

2.4RT-PCR法检测大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4 mRNA表达12 h组、24 h组以及48 h组大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4 mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)，同时随着时间的延长，其mRNA表达水平呈逐步升高的趋势，其中24 h和48 h组明显高于12 h组(P<0.05)，48 h组明显高于24 h组(P<0.05)。见图3和表2。

表1　ELISA法检测各组大鼠角膜组织中炎性因子水平

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 12 h group；#P<0.05 compared with 24 h group.

Lane 1,2:Control group; Lane 3,4:12 h group; Lane 5,6:24 h group; Lane 7,8:48 h group.

图3各组大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4 mRNA表达电泳图

Fig.3Electrophoregram of expressions of Dectin-1 and TLR4 mRNA in corneal tissue of rats in various groups

表2Dectin-1/β-actin 和TLR4/β-actin 的定量分析

Tab.2Quantitative analysis of Dectin-1/β-actin and TLR4/β-actin

GroupDectin-1TLR4Control0.31±0.010.19±0.01Fungalkeratitis 12h0.78±0.03*0.58±0.03* 24h1.05±0.05*△0.90±0.05*△ 48h1.45±0.04*△#1.17±0.04*△#

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 12 h group；#P<0.05 compared with 24 h group.

2.5Western blotting法检测大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4蛋白表达12 h组、24 h组和48 h组大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)，随着时间的延长，其蛋白表达水平呈现逐渐升高的趋势，其中24 h和48 h组明显高于12 h组(P<0.05)，48 h组也明显高于24 h组(P<0.05)。见图4和表3。

Lane 1,2:Control group; Lane 3,4:12 h group; Lane 5,6:24 h group; Lane 7,8:48 h group.

图4各组大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4蛋白表达电泳图

Fig.4Electrophoregram of expressions of Dectin-1 and TLR4 in corneal tissue of rats in various groups

表3Dectin-1/β-actin 和TLR4/β-actin 的定量分析

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 12 h group；#P<0.05,compared with 24 h group.

3　讨　论

烟曲霉菌属于曲霉菌属中一种最为常见的、同时也是致病性最强的一种病原菌，近年来关于烟曲霉菌感染角膜致使其发生炎症的报道越来越多，同时相关研究报道也逐年增加，但关于其感染的确切机制还没有明确的文献报道[5]。烟曲霉菌角膜炎是最严重的感染性角膜病之一，由于一般抗菌药物难以完全杀死烟曲霉菌，所以治疗难度大，一经感染常引起角膜溃疡和角膜穿孔，甚至可能发生失明[6-7]。我国由于人口众多，同时人们之间交流频繁，致使本病发病率逐年升高[8]，给患者带来了严重身心负担。

Dectin-l是一种较为常见的C型凝集素样模式识别受体，其在体内主要由DCs以及巨噬细胞表达，该蛋白一般表达量极少，当真菌感染后，巨噬细胞可识别真菌细胞壁上的甘露聚糖以及葡聚糖，导致Dectin-l信号通路激活，促进Dectin-l的大量分泌[9-11]。Balderramas等[12]研究发现：Dectin-1可以与ITAM结合，激活NF-κB信号通路，进而造成炎性反应的发生，促进IL-1和IL-6等炎症因子的释放。TLR是人体内一种较为常见的天然免疫受体，以往的研究证实TLR基因与果蝇胚胎背、腹侧的发育有关[13-15]。随着研究的不断深入，医学界证实哺乳动物体内也有类似的同源性受体，同时将这一类受体归为TLR家族，这其中TLR4是最为常见的一种[16]，其可以介导内毒素/脂多糖应答的最主要受体，与TLR4细菌感染引起的脓毒血症以及炎症因子IL-10有密切关联[17]，当真菌感染发生后，Dectin-l可与TLR4共同作用，促进炎症反应发生。

目前国内还没有关于烟曲霉菌角膜炎中Dectin-1以及TLR4联合作用促进角膜炎发生和发展的研究。本研究结果显示：大鼠造模均成功，在烟曲霉菌感染12 h后，角膜组织中炎症因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB表达水平明显高于对照组;免疫组织化学、Western blotting法和RT-PCR法测定大鼠眼角膜组织提取液，12 h、24 h和48 h组大鼠角膜组织中Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表达水平也明显高于对照组。本研究结果并结合文献报道[12，17]综合提示：烟曲霉菌感染可以促进Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表达，Dectin-1表达水平的升高，促进了NF-κB过量分泌，而NF-κB过量分泌又进一步促进了IL-1和IL-6表达水平的升高， TLR4表达的升高则促进了角膜炎性因子IL-10过度分泌，最终促进了真菌性角膜发生。

综上所述，Dectin-1和TLR4是炎性促发因子，在烟曲霉菌感染后可促使其过量分泌，造成大鼠炎性相关因子表达，促进了角膜炎的发生。

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Expressions of TLR4 and Dectin-1 in cornea tissue of rats with Aspergillus fungal keratitis and their effects in pathogenesis of keratitis

REN Yi,GAN Shengwei,LI Pinghua

(Department of Ophthalmology，First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo explore the expressions of Dectin-1 and Toll-like receptor 4 (TLR4) and the secretory charateristics of inflammatory factors of theAspergillusfumigatusinfected cornea of the rats,and to clarify theirs role in the pathogenesis of rat keratitis.Methods 40 SD rats were separated into control group(n=10) and aspergillus keratitis group(n=30).The rats in aspergillus keratitis group were infected byAspergillusfumigatusin two eyes for 12,24 and 48 h,and the cornea tissue was took and ELISA kit was used to detect the level of inflammatory cytokines IL-1,TNF-a,IL- 6,IL-10,and NF-κB; immunohistochemistry,Western blotting and RT-PCR methods were used to determine the Dectin-1 and TLR4 protein and mRNA expressions.ResultsThe rat models were successfully established.The eyes of the rats in control group were limpid tested by corneal slit lamp,however,there existed a clear boundary film on the surface of eyes of the rats in aspergillus keratitis group infected for 12 h,white infiltrates and bloodshot in the eyes in 24 h group and the white infiltrates were further strengthened and almost covered the entire eyes in 48 h group. The order of inflammatory cytokines IL-1,TNF-α,IL-6,IL-10,NF-κB was:48 h group>24 h group>12 h group>control group(P<0.05),so did the expression levels of Dectin-1 and TLR4 protein and mRNA in various groups tested by Western blotting and RT-PCR methods.The expression levels of Dectin-1 and TLR4 were increased with the prolongation of time investigated by immunohistochemical staining.ConclusionDectin-1 and TLR4 are secreted in excess after the eyes are infected with fumigatus,which promotes the expressions of related inflammatory cytokines and results in the occurrence of keratitis.

fungal keratitis;Aspergillusfumigatus; Dectin-1; Toll-like receptor

1671-587Ⅹ(2015)06-1176-05

10.13481/j.1671-587x.20150615

2015-02-26

重庆市科学技术委员会科技项目资助课题(cstc2011jjA10003)

任毅(1981-)，男，四川省邻水县人，主治医师，在读医学硕士，主要从事角膜及眼表疾病方面的研究。

李平华，教授，硕士研究生导师(Tel：023-68894420， E-mail:lipinghua@126.com)

R772.21

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