键合靶向纳米胶束对脑胶质瘤细胞的组织相容性和靶向性

韩海玲，苗　壮,岳　军，赵长福,景遐斌,金顺子，王占峰,

(1.吉林大学公共卫生学院 卫生部放射生物学重点实验室，吉林 长春130021；2. 北华大学附属医院，吉林吉林 132011；3.吉林大学中日联谊医院神经外2科，吉林 长春 130033；4.中国科学院长春应用化学研究所 高分子物理与化学国家重点实验室，吉林 长春 130022 )

键合靶向纳米胶束对脑胶质瘤细胞的组织相容性和靶向性

韩海玲1，2，苗壮3,岳军4，赵长福2,景遐斌4,金顺子1，王占峰2,3

(1.吉林大学公共卫生学院 卫生部放射生物学重点实验室，吉林 长春130021；2. 北华大学附属医院，吉林吉林 132011；3.吉林大学中日联谊医院神经外2科，吉林 长春 130033；4.中国科学院长春应用化学研究所 高分子物理与化学国家重点实验室，吉林 长春 130022 )

目的：探讨转铁蛋白受体的单克隆抗体(OX26)与聚乳酸聚乙二醇(PEG-PLA)键合靶向纳米胶束(copolymer/OX26)的生物相容性和安全性，阐明其作为脑胶质瘤靶向治疗载体的可行性。方法：体外培养C6胶质瘤细胞，用不同浓度(10.0、20.0、40.0和80.0 mg·L-1)纳米胶束作为实验组，不含胶束的培养液作为对照组；台盼蓝染色法检测靶向纳米胶束对胶质瘤C6细胞的增殖抑制作用；流式细胞术检测靶向纳米胶束作用后C6胶质瘤细胞凋亡和细胞周期变化；激光共聚焦显微镜观察肿瘤细胞对靶向胶束的摄入情况。结果：与对照组比较，OX26靶向纳米胶束作用后C6细胞数无明显改变(P>0.05)， 各组细胞凋亡率和细胞周期细胞比例差异亦无统计学意义(P>0.05)；靶向纳米胶束组细胞内的荧光强度明显高于空白胶束组和空白对照组(P<0.05)，并且这种作用随药物作用时间和浓度的增加而增加。结论：OX26靶向纳米胶束对C6细胞增殖和凋亡无影响，键合OX26提高了C6细胞对胶束的摄入量。

神经胶质瘤；靶向纳米胶束；转铁蛋白受体；组织相容性

脑胶质瘤是颅内常见肿瘤，发病率占颅内肿瘤的40%。紫杉醇(paclitaxel， PTX)等多种一线新型抗肿瘤药物对治疗多种肿瘤有效，但因血脑屏障的存在限制其在颅脑疾病中的应用[1-2]。因此，寻找有效的药物载体成为目前脑胶质瘤化学治疗研究的热点。研究[3]表明:转铁蛋白受体(transferring recepter,TfR)存在于脑BBB细胞壁上，借助TfR介导的内吞途径，转铁蛋白(transferrin，Tf)能顺利通过BBB细胞。但Tf是血浆中主要的含铁蛋白质之一，且与BBB细胞上TfR的结合接近饱和，留给外源药物——Tf复合物的机会很少。因此Tf自身不适于作为药物转运载体。研究者利用分子生物学手段，制备出多种TfR的单克隆抗体，如OX26就是其中之一，其与TfR能发生特异性地识别和结合，借助于TfR介导的内吞途径，OX26能顺利通过BBB细胞。而且，OX26与TfR的结合位点不同于Tf与TfR的结合位点，因而OX26和Tf间不存在互相竞争和抑制，大量内源Tf的存在不影响对OX26/药物复合物的转运。因此有研究者[4-5]用OX26作为药物载体，向中枢神经系统转运药物。本课题组率先与中国科学院长春应用化学研究所景遐斌研究员合作，通过化学键合的方法，将转铁蛋白受体单克隆抗体OX26与PEG-PLA键合成靶向纳米胶束(copolymer/OX26)，有望改变传统化疗药物的理化特性，其作为脑靶向药物载体具有广阔的应用前景。目前，关于纳米材料的生物安全性、生物效应及对人体健康的潜在影响也逐渐受到重视[6]。因此，本研究从OX26-聚乳酸聚乙二醇(PEG-PLA)纳米胶束对脑胶质瘤靶细胞的影响及生物学效应方面进行探讨，为键合靶向纳米胶束作为颅脑肿瘤靶向药物载体的生物效应及安全性进行分析，为进一步临床应用奠定实验基础。

1　材料与方法

1.1细胞、主要试剂和仪器大鼠C6胶质瘤细胞系(C6细胞)由吉林大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室提供。培养基：RPMI 1640 (Sigma公司， 美国) + 10% (体积比)热灭活小牛血清 + 青霉素100 U·mL-1+ 链霉素100 U·mL-1,pH为7.2～7.3,过滤消毒。小牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品。青霉素和链霉素由华北制药厂生产。化学键合紫杉醇即PEG-PLA/PTX自制：10 mg PEG-PLA/PTX溶解于5 mL DMF 中，置于透析袋中,用1 000 mL 二次蒸馏水透析24 h，每4 h更换1次双蒸水。透析完成后离心，取上清，冷冻干燥，置4℃保存。混合胶束表面键合单克隆抗体(OX26)：首先利用Trauts试剂在抗体上引入自由巯基，然后巯基化的抗体与表面含马来酰亚胺的混合胶束在温和条件下通过Michael加成反应固定在胶束表面(中国科学院长春应用化学研究所提供)。原料药紫杉醇购自西安宝赛生物科技有限公司。二氯甲烷(DCM)为分析纯，购自北京化工厂。乙腈为色谱纯，购自上海复旦化学试剂有限公司。二次蒸馏水，使用SZ-93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)制备。磷酸盐缓冲溶液(PBS)，配制浓度为0.01 mol·L-1(pH7.4)。透析袋为醋酸纤维素材质，截流相对分子质量35 000。FV 1000型共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)。

1.2台盼蓝染色实验消化对数生长期的C6细胞，制成2×105mL-1细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔100 μL悬液(2×104个细胞)，分别加入200 μL浓度为0(空白对照组)、10、20、40和80 mg·L-1的空白OX26-PEG-PLA(相当于PTX浓度为0、10.0、20.0、40.0和80.0 mg·L-1)/RPMI 1640溶液，培养1、2、3、4和5 d，采用台盼蓝染色法检测各组的细胞数，观察载体材料OX26-PEG-PLA的细胞毒性。

1.3流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期消化C6细胞，以5×105mL-1细胞悬液接种25 cm2培养瓶，24 h后更换培养液，分别加入PTX浓度为0、40.0和80.0 g·mL-1浓度的OX26-PEG-PLA胶束/RPMI 1640溶液，此时间点被称为第0天。在第3天分别收集各组细胞，加入0.5 mL冰冷的70%乙醇中， -20℃冰箱保存。将制备好的单细胞悬液以1 000 r·min-1离心10 min,弃去固定液，冷PBS漂洗2次(1 000 r·min-1,5 min)，调整细胞为1×109L-1，加入PI染液1.0 mL，避光染色30 min，上机分析，用ModFit 软件收集、贮存和分析数据，获得各组细胞的凋亡率和各细胞周期的细胞分布情况。见表1。

1.4激光共聚焦显微镜检测标记的胶束与C6细胞作用后细胞内的荧光强度用1% PBS缓冲液冲洗预先接种在盖玻片上的C6细胞3次，加1.25 mg·L-1荧光标记胶束(由中国科学院长春应用化学研究所制备)，各组分别为：空白对照组、空白胶束、OX26-PEG-PLA-DHC/20 mg·L-1、OX26-PEG-P(LA-DHC/40 mg·L-1)，37℃避光孵育特定时间，洗涤细胞，3.7%多聚甲醛固定12 min,PBS洗片,50 μL PBS/甘油混合溶液(体积比1∶1)封片。激光共聚焦显微镜下观察(TRITC的激发波长为550 nm，发射波长620 nm) 。

2　结　果

2.1C6胶质瘤细胞形态学倒置显微镜观察可见肿瘤活细胞形态基本一致：经80 mg·L-1空白纳米胶束处理72 h的细胞可见细胞排列整齐，细胞大小形态趋向一致。与对照组比较,细胞核/质比例无明显变化。见图1。台盼蓝染色结果：纳米胶束作用后，实验组与对照组细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。10、20、40和80 mg·L-1浓度的各空白OX26-PEG-PLA处理组细胞数随着时间的增加而增加，与空白对照组细胞数相似；与对照组和作用1 d比较，作用5 d各实验组细胞明显增殖(P<0.05)，但各实验组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

A：Control group (24 h);B：80 mg·L-1copolymer micelles group (24 h)；C：Control group (72 h); D：80 mg·L-1copolymer micelles group (72 h).

图1倒置显微镜观察各组C6细胞形态学表现(×200)

Fig.1Morphology of C6 glioma cells in various groups observed with inverted microscope (×200)

2.2各组细胞凋亡率和细胞周期变化40 mg·L-1PEG-PLA、10和40 mg·L-1OX26胶束作用72 h后,C6细胞凋亡率与对照组比较未见明显改变(P>0.05)。与对照组比较，OX26-PEG-PLA-DHC/作用后G0/G1、S和 G2/M细胞周期的C6细胞比例未见明显改变(P>0.05)。见表2。

表1　各组不同时间C6细胞数

表2　各组C6细胞凋亡率和细胞周期

2.3各组C6细胞对荧光标记胶束的摄入量激光共聚焦显微镜下观察荧光情况并计算荧光强度值，如表3所示。靶向胶束作用2 h的荧光强度高于作用1 h(P<0.05)；40 mg·L-1组强度明显高于20 mg·L-1组(P<0.05)；靶向胶束组荧光强度明显高于胶束组(P<0.05)。

表3各组C6细胞中摄入药物的荧光强度

*P<0.05 compared with 1 h;△P<0.05 compared with OX26-PEG-PLA-DHC/PTX/20 group;#P<0.05 compared with PEG-PLA-DHC/PTX/40 group.

3　讨　论

研究[7-8]表明:由于血脑屏障的存在限制了化疗药物在脑肿瘤治疗中的应用。紫杉醇作为目前治疗多种肿瘤有效的一线化疗药物，由于其溶解度低，透过血脑屏障差限制了其在脑胶质瘤治疗中的应用。药物如何透过血脑屏障成为目前研究热点。

纳米胶束(粒径一般小于100 nm)作为一种新型药物释放载体，具有粒径分布均匀、载药范围广、结构稳定、体内滞留时间长、载药量高和可透过血脑屏障等独特的体内分布特点，同时可通过表面修饰链接不同靶向基元，实现胶束药物的肿瘤靶向作用。作为理想的靶向载药纳米材料应具有键合药物包封率高、担载药物能够满足治疗的需要、较强靶向性、组织相容性好和易控制的药物释放过程[9-10]等特点。

本研究制备的纳米胶束具有抗癌药增容(PTX在水中的溶解度约1 mg·L-1)、抗癌药保护和可控释放，将PTX包裹在胶束的芯层，OX26处于胶束的最外层。靶向基元在外面是实现靶向的需要，但是OX26是一种蛋白质，在血液环境和组织环境中，容易受到人体免疫系统的攻击，被拦截， 甚至被清除，所以将OX26键合在聚合物的疏水端(段),得到PEG-PLA-OX26，由于OX26是亲水的，相当于一个三嵌段聚合物,使OX26受到PEG链段的保护，但OX26仍然处在水环境中，可与TfR接触，保持靶向功能。为了调节OX26在纳米胶束中的位置，拟选用不同长度的间隔基(spacer)将OX26键合在PEG-PLA的亲水端，即形成OX26-PEG-PLA和(或)OX26-PEG-PLA-PTX 2种键合物，实现对OX26蛋白质的保护，又不妨碍OX26靶向功能的发挥[11-12]。

本研究通过将转铁蛋白受体单克隆抗体OX26作为靶向基元，PEG-PLA为载体构建担载紫杉醇的靶向纳米胶束，利用OX26介导的内吞，将抗癌药物送入胶质瘤细胞，通过激光共聚焦显微镜检测证实OX26可提高胶质瘤对纳米胶束的摄入量，从而实现将化疗药物输送到脑胶质瘤细胞，实现严格意义上的脑胶质瘤的瘤细胞靶向。通过MTT检测证实：OX26靶向纳米胶束对胶质瘤细胞增殖无影响，未见明显不良反应，表明OX26-PEG-PLA-DHC纳米胶束对肿瘤细胞生长无影响。细胞凋亡是通过基因调控的细胞自杀现象,在正常组织分化和肿瘤治疗中具有重要意义,肿瘤的治疗在某种程度上就是诱导肿瘤细胞凋亡的过程[13-14]。抗肿瘤药物的抑瘤作用多是通过减少细胞的有丝分裂、促进细胞凋亡实现。本研究中流式细胞术检测结果表明：胶束含量的增加对肿瘤细胞的凋亡率和细胞周期无影响。理想的肿瘤靶向药物除具有良好的细胞相容性，还应具有良好的细胞靶向性，激光共聚焦检测显示：键合转铁蛋白受体单克隆抗体(OX26)后能明显提高C6胶质瘤细胞对胶束的靶向摄入[14-16]。

综上所述，通过键合的方法将转铁蛋白受体单克隆抗体-OX26键合到PEG-PLA 作为骨架的纳米胶束上，可增加细胞对药物的摄入量，且空白胶束对脑胶质瘤细胞增殖无明显影响，有较好的生物相容性，可能成为肿瘤细胞靶向治疗载体。

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Biocompatibility and brain-targeting ability of nano-micelles on glioma cells

HAN Hailing1，2, MIAO Zhuang3,YUE Jun4,ZHAO Changfu2,JING Xiabin3，JIN Sunzi1,WANG Zhanfeng2,3

(1.Key Laboratory of Radiobiology,Ministry of Health School of Public Health,Jilin University,Changchun 130021,China; 2.Affliatted Hospital, Beihua University,Jilin 132011,China;3.Department of Neurosurgery,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun 130033,China;4.State Key Lab of Polymer Physics and Chemistry,Changchun Institute of Applied Chemistry, Changchun 130022,China)

ObjectiveTo investigate the biocompatibility and safety of nanoscale brain-targeting-carrier micelles[poly(ethylene)-b-poly(lactic acid) /OX26 conjugate micells(copolymer/OX26)],and to explore its possibility as brain-targeted-drug carrier for brain glioma.MethodsThe C6 glioma cells were culturedinvitroand divided into experimental groups with different concentrations (10,20,40，80 mg·L-1) of nano micelle,and the medium without micelle was used as control group.The inhibitory effect of nano-micelles on the rat brain glioma C6 cells was examined by Trypan blue cell counting assay.Flow cytometry (FCM) was used to detect the changes of apoptosis and cell cycle of C6 cells,and confocal laser scanning microscope (CLSM) was performed to analyze the distribution of copolymer/OX26 into C6 cells.ResultsThe results of Trypan blue cell counting assay showed copolymer/OX26 didn’t affect the growth of C6 cells,and there were no significant differences in the number of C6 cells between control group and expreimental groups(P>0.05).The results of FCM showed that the cell cycle and and the apoptotic rates of C6 cells had no changes compared with control group(P>0.05).The results of CLSM showed that the fluorescence intensities in experimental groups were higher than those in blank micelles group and blank control group(P<0.05),and they were increased in dose- and time-dependent manner(P<0.05).ConclusionCopolymer/OX26 has no effect on the growth and apoptosis of glioma cells.By bonding OX26, copolymer/OX26 can significantly increase the intake of C6 cells on the nano micelles.

glioma; brain-targeting-carrier micelles;transferrin receptor;histocompatibility

1671-587Ⅹ(2015)06-1134-05

10.13481/j.1671-587x.20150607

2015-05-05

国家自然科学基金资助课题(20904002)；教育部新世纪优秀人才计划项目资助课题(NCET-10-0171)；吉林省科技厅青年基金资助课题(20130522020JH)；吉林省高技术产业发展专项资助课题(JF2012C005-2)；吉林省教育厅十一五重大课题(2009139)；吉林大学白求恩医学科研支持计划项目资助课题(2013107027)

韩海玲(1977-)，女，吉林省松原市人，副主任医师，在读医学博士，主要从事脑血管病的生物治疗和基础方面的研究。

王占峰，副主任医师，硕士研究生导师(Tel：0431-84995718，E-mail：1206hhl@sina.com)

R739.4

A

网络出版时间:2015-11-11 16:30:34

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.r.20151111.1630.002.html