限制性胎盘嵌合体对产前诊断的影响

周希亚，戚庆炜，郝娜，周京，刘俊涛，边旭明

（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院，北京 100730）

限制性胎盘嵌合体（CPM）是指胎盘内同时存在染色体正常和异常的细胞系，而胎儿染色体正常的情况。在早孕期绒毛活检（CVS）操作中，CPM 的发生率为1%～2%［1－2］，其中30%～50%的CPM会在妊娠过程中丢失胎盘非整倍体细胞系［3］。而在异常细胞持续存在的病例中，CPM可能会增加不良妊娠结局的风险。虽然最早的CPM报道距今已有30余年［1］，但我国文献中对CPM的系统研究及报告仍很鲜见［4－5］。本文回顾性分析了我院2013年早孕期绒毛活检中发现的2例CPM患者，参考近年来国内外的相关文献报道，探讨CPM的发生、妊娠结局、产前咨询与随访处理，及其对无创产前检测（NIPT）、植入前遗传学筛查（PGS）的影响。

资料与方法

一、研究对象

对2013年我院产科收治的存在高龄妊娠、胎儿颈部透明层增厚、染色体异常胎儿分娩史的211例妊娠妇女行经腹CVS检查，发现2例CPM患者，CPM发生率为0．9%。此2例患者的产前诊断情况见表1。

表1 CPM患者的产前诊断情况

CPM的产前诊断：采用绒毛长期培养法［4］，进行G显带核型分析，如发现绒毛标本嵌合，再经后续羊膜腔穿刺或脐血穿刺确认，诊断为CPM。

二、研究方法

1．CVS操作：穿刺前认真核对适应证、妊娠周数、子宫大小、有无穿刺禁忌证等。B超测量胎儿头臀长以核对孕周，了解有无胎心，定位胎盘位置，选择穿刺部位。在超声引导下，选用双针套管，将引导套针经腹壁及子宫穿刺入胎盘。拔出针芯，将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛组织。连接含有2～4ml生理盐水的20ml注射器，以5ml负压上下移动活检针吸取绒毛组织。拔针后立即观察胎盘部位有无出血及胎心情况。

2．绒毛培养及染色体制备：无菌条件下，用无菌生理盐水将绒毛组织洗净，去除红细胞及蜕膜组织、非绒毛组织。用无菌剪刀剪碎组织后，加入1ml酶解液（自配，含 0．02%EDTA、0．25% 胰酶和900U／ml的胶原酶），吹打均匀后置于37℃水浴中20～30min，取出后进行离心操作，弃上清后，加入Amniomax培养液（GIBCO，美国）4ml，混匀后置于培养瓶中，37℃CO2培养箱中培养2～3d，至有贴壁细胞并形成多个克隆后即采用原位法收获细胞。

每个培养瓶中加入20μl类秋水仙素溶液（GIBCO，美国），调整终浓度为25μg／ml，室温或37℃水浴中作用15min，倒掉液体加入1%枸櫞酸钠溶液（自配）4ml，室温或37℃水浴中低渗作用40min，加入1ml 3∶1固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1，自配）预固定2min，倒掉液体后，加入1．5ml 3∶1固定液涮壁后倒掉，重新加入固定液4ml作用20min，倒掉液体后再加入固定液4ml作用10min，此步骤重复一次后将培养瓶上盖掀掉、甩出液体即可烤片，进行染色体分带染色。

3．羊水细胞培养及染色体制备：在B超引导下经腹抽取羊水20ml，离心后弃上清，每管加入1ml Amniomax培养液后混匀，将细胞悬液分别加入4个带玻片平皿中的盖玻片上（每个0．5ml），置于CO2培养箱中培养24h后，向每个平皿中追加1．5ml培养液继续培养72h。此后每天显微镜下观察细胞形态，观察到较好的梭形细胞克隆时更换培养液，于24h后收获细胞。

向每个平皿中加入20ng／ml秋水仙素12μl，置于37℃培养箱中继续培养2h，弃去培养液，加入0．8%枸櫞酸钠溶液2ml进行低渗，37℃培养箱中继续培养20～30min后在相差显微镜下观察，若细胞透亮浑圆，则缓慢加入3∶1固定液逐步固定。室温下控干后置于55℃加热平台上烤片，再置于37℃温箱中过夜，最后用树脂胶将盖玻片贴在干净的载玻片上备用。在0．25%胰酶溶液中作用15s后Gi－emsa染色，滤纸吸干多余水分后显微镜下观察。

4．单核苷酸多态性微阵列分析：采用美国Affymetrix公司的Cytoscan 750K芯片平台进行单核苷酸多态性微阵列分析。取600μl新生儿外周血采用德国QIAGEN公司试剂盒及其标准DNA抽提方法提取DNA，并测定样本浓度。经酶切、连接、聚合酶链反应（PCR）、PCR产物鉴定、纯化、定量、片段化、标记、杂交后，对芯片进行洗涤、染色及扫描，得到数据经Affymetrix自带软件转换，并通过染色体分析软件ChAS（Chromosome Analysis Suite Software）进行分析。

结 果

一、2例患者的培养及核型分析结果

患者1绒毛培养及核型分析结果显示为15－三体与正常核型的嵌合，羊水细胞培养及核型分析则仅见1个核型15－三体。患者2绒毛培养及核型分析结果显示7－三体与正常核型的嵌合，脐血穿刺及核型分析结果未见异常。

临床分析认为患者1不能除外假性嵌合或低水平的真性嵌合，CPM可能性大；嵌合为单亲二倍体的诊断带来困难，经遗传咨询后，该例患者选择继续妊娠。患者2CPM诊断明确，经遗传咨询后，选择继续妊娠。

二、CPM的妊娠结局

患者1于孕38周4d剖宫产1女性活婴，Apgar评分10分，新生儿体重3 220g。经知情同意后，取新生儿外周血培养并行400～450条带核型分析，未见异常核型。单核苷酸多态性微阵列分析结果为arr（1－22）x2，XYx1。

患者2孕32周时发现胎儿宫内生长受限，定期B超监测胎儿生长发育情况，维持妊娠至37周2d剖宫产1男性活婴，Apgar评分10分，新生儿体重2 340g，为小于胎龄儿，转儿科处理。取胎盘多点样本，行320条带染色体分析，胎盘边缘100%为47，XY＋7，胎盘中央近胎儿面100%为46，XY，胎盘近脐带根部母体面细胞25%为47，XY＋7，75%为46，XY。

讨 论

一、CPM的发生

1983年，Kalousek和Dill发现，在不明原因宫内发育受限的婴儿的胎盘中存在CPM［1］。理论上，由于胎盘与胎儿来自同一受精卵，其染色体核型应当一致。但是在CPM的病例中，异常染色体核型（数目或结构异常）的细胞系仅存在于胎盘，而胎儿核型正常［2］。

目前，CPM的分类有以下两种情况，一是根据发生机理，CPM可以分为减数分裂型及有丝分裂型：减数分裂型是指受精卵染色体异常（通常为三体），在之后的分裂中，由于“错误”导致囊胚内细胞团中形成胚胎的细胞丢失了异常染色体，成为46，XN，而其余的异常细胞被“驱赶”至滋养细胞层，这个过程被称为“三体合子挽救”（trisomic zygote rescue）或“胎儿自救”（fetal rescue）；有丝分裂型则是指受精卵为二倍体，异常分裂发生在胎盘细胞的前体中。另一种是按照所累及的绒毛细胞，CPM可以分为3型：Ⅰ型CPM，染色体异常只存在于细胞滋养细胞，因此仅在短期培养后能见到；Ⅱ型CPM，染色体异常局限于绒毛的间质核心，只有经过长期培养后方可见到；Ⅲ型CPM，染色体异常既存在于细胞滋养细胞，也存在于间质核心，短期培养和长期培养后均可见到［6］。因此对绒毛同时进行短期培养和长期培养，可以更准确地诊断CPM及其分型。本研究中，由于取材量的限制，我院采用的是长期培养法，故未能对CPM进行准确分型。有研究报道，妊娠9～12周时通过CVS进行产前诊断的病例中，CPM的发生率约为1%～2%［1－2］，而普通人群中 CPM 的真实发生率目前尚不清楚。16－三体是CPM中最常见的非整倍体，其他常见的非整倍体包括2、7、9、15和22号染色体三体［6］。

二、CPM的妊娠结局

继Kalousek和Dill发现CPM与胎儿宫内生长受限相关后，许多学者希望能证实这一相关性，但研究结果并不一致。有研究发现CPM与不良妊娠结局有关，包括流产、胎儿宫内生长受限、早产等［7－12］，而另一些研究则未能证实CPM导致不良妊娠结局［13］。有学者对不明原因的胎儿宫内生长受限进行了研究，发现 CPM 的比例显著增高［8－10］，但大多数研究仍集中于早孕期CVS诊断的CPM病例，未发现分娩孕周、新生儿体重在CPM组与对照组间存在统计学差异。表2展示了部分文献病例对照研究的结果。

表2 CPM对妊娠结局影响的部分病例对照研究

研究结果的不一致，一方面可能是因为大多数研究样本量较小，研究结果存在一定的偏倚；另一方面可能因为CPM对胚胎及胎儿发育的影响与诸多因素有关，包括染色体受累的时间、染色体异常的类型、受累染色体本身的性质，以及足月胎盘的嵌合比例等。有研究报道，Ⅰ型CPM患者往往出现流产或胎儿宫内生长受限［7］；有些染色体异常容易造成自然流产，表明这些染色体的CPM可能是减数分裂型，例如16－三体的 CPM［1］；而另一些染色体的CPM可能是有丝分裂型，例如8－三体的CPM［1］。此外，并非所有早孕期CVS诊断的CPM患者都能维持到妊娠足月，足月胎盘是否仍存在嵌合以及嵌合程度可能与妊娠结局相关。有研究发现，9号、16号染色体三体／二倍体嵌合的CPM患者最易维持至足月［6］。Wilkins－Haug等［14］对70例胎儿宫内生长受限的病例进行病例对照研究发现，胎儿宫内发育受限的患者其胎盘存在高水平的四倍体嵌合。因此，要想准确解释CPM对妊娠结局的影响，必须对足月胎盘进行全面地分析。在缺乏胎盘染色体结果的情况下，很难评价CPM与妊娠结局之间的关系。对于不明原因的胎儿宫内生长受限，建议在分娩时留取多点胎盘组织进行染色体分析。本研究中我院2013年仅收集到的2例CPM患者中，病例2存在胎儿宫内生长受限，胎盘多点染色体分析证实了妊娠足月时胎盘依旧存在嵌合状态。

三、CPM的咨询与随访

CVS检查所取标本为早孕期胎盘绒毛，主要为细胞滋养细胞及绒毛间质，并非真正的胎儿组织。因此，当CVS检查发现嵌合时，首先应分析胎儿真性嵌合的可能性。例如，CVS检查发现21－三体嵌合，表示胎儿也可能存在21－三体，无论胎儿本身是否为嵌合体。8、9、12、13、15、18和20－三体的嵌合也存在类似风险。而CVS检查发现2、3、5、7、10、11、14、16、17－三体嵌合时，胎儿核型往往并无异常［15］。

对于减数分裂型CPM，三体受精卵“胎儿自救”过程中会丢失掉一条染色体，因此剩余的两条染色体有可能来自同一个亲本，即出现单亲二体（UPD）。因此，对于那些可能存在印记基因的染色体，例如当发现涉及5、6、7、9、11、14、15、16号染色体的 CPM 时，应当进行 UPD 检测［16－17］。

当CVS核型分析提示嵌合体结果时，遗传咨询首先应分析CPM的可能性。告知孕妇绝大多数的嵌合并不意味着胎儿异常，应当进行羊膜腔穿刺或脐血穿刺再次进行核型分析；但另一方面也应说明，即使后续诊断核型正常，胎儿仍可能存在低水平的嵌合，但不一定影响表型。Stetten等［18］随访了29例CPM患者的新生儿，其中2例存在低水平的嵌合。由于CPM与妊娠结局之间的关系比较复杂，妊娠期间难以预测，因此，对CPM患者胎儿的生长发育应予以重视，对宫内生长受限的胎儿应加强大脑中动脉及脐动脉血流的监测，并适时终止妊娠。产后应对胎盘及新生儿进行染色体分析。

四、CPM对新技术的挑战

随着测序技术的发展，近年来，母血胎儿游离DNA被用于胎儿非整倍体检测，即无创产前检测技术（NIPT）。但有研究发现，CPM是造成NIPT检测假阳性的重要因素［19－23］。因为所谓的胎儿游离DNA，并非来自胎儿，而是来自胎盘细胞。胎盘嵌合体的存在，将导致假阳性结果的发生，表3列出了CPM导致NIPT检测假阳性的部分研究（截至2013年）。因此，在获得NIPT结果后，建议再行羊膜腔穿刺或脐血穿刺进行产前诊断。

表3 CPM导致NIPT检测假阳性的部分研究

近年来，植入前遗传学筛查技术（PGS）也逐渐发展。van Echten－Arends等［24］研究报道，行 PGS检测的卵裂球中，59%是二倍体／非整倍体的嵌合体。Northrop等［25］研究报道，16%的囊胚为嵌合体。由于植入前高比例的嵌合，在PGS过程中，采用极体、第3天卵裂球中的单个细胞、或者囊胚滋养细胞层（将来形成胎盘）的多个细胞，都有可能导致PGS认为二倍体的胎儿为非整倍体，从而被错误地排除。

到目前为止，CVS核型分析的嵌合状态仍是产前诊断和咨询中的难点。CPM的发生率较低，需要通过羊膜腔穿刺或脐血穿刺、核型分析诊断。对于某些染色体而言，诊断CPM时要除外UPD的存在。CPM可能造成NIPT、PGS的假阳性结果，因此，NIPT检测阳性仍需核型诊断。由于CPM可能对产前诊断造成上述影响，临床医生应当重视CPM的存在，加强对CPM的遗传咨询。对于存在CPM的妊娠，孕期应加强对胎儿生长发育的监测，分娩时留取胎盘多点取材，分别检测染色体核型。

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