海水养殖渔用抗生素有效含量及其抑菌效果比较研究

赵　莉，施　慧，李佩佩，王庚申，谢建军，许文军

（1.浙江省海洋水产研究所，浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山　316021；2.浙江海洋学院水产学院，浙江舟山　316022）

海水养殖渔用抗生素有效含量及其抑菌效果比较研究

赵莉1，2，施慧1，李佩佩1，王庚申1，谢建军1，许文军1

（1.浙江省海洋水产研究所，浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山316021；2.浙江海洋学院水产学院，浙江舟山316022）

为了对浙江常见海水养殖渔用抗生素的杀菌效果进行比较分析，本研究首先采用高效液相色谱法（HPLC）和超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（ΜPLC-ESI-MS/MS）对8种常见的渔用喹诺酮类抗生素及5种氟苯尼考药物的有效成分含量进行了测定。结果:13种渔药的实际有效成分含量与标示含量不符的现象较为突出：8种喹诺酮类药物中只有4种药物的有效成分含量与标示含量基本一致，其它均低于标示含量，其中含量最低的只有标示值的59.2%；5种氟苯尼考类药物中3种药物的有效成分含量与标示含量基本一致，其余2种有效含量仅为标示值的25%。同时，本研究运用液体培养基连续稀释法对上述抗菌药物开展了针对常见海水致病菌——溶藻弧菌MIC和MBC的测定，结果：喹诺酮类药物的MIC和MBC值介于2.28～18.94 mg/L之间；氟苯尼考渔药的MIC和MBC值介于0.022～4.48 mg/L之间，其中溶液型氟苯尼考的MIC和MBC值较低，均为0.022 mg/L，表明所测的几种喹诺酮类和氟苯尼考药物均对受试菌敏感。

喹诺酮；氟苯尼考；高效液相色谱法；超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度

细菌性疾病是危害海水养殖业的一类主要病害，每年给养殖业造成了巨大的经济损失。药物防治是目前水产养殖细菌性疾病防控采取的重要手段之一，由于当前渔药市场的产品质量良莠不齐，养殖户难以对药物准确用量形成统一标准，所以造成了水产养殖中乱用、滥用渔药的现象。渔药的乱用、滥用不仅造成了细菌耐药性的增强的后果，同时也威胁到了养殖环境稳定和水产品的质量安全。为了对渔用抗生素的杀菌效果进行准确评价以规范水产养殖中正确使用渔药，本文对市售渔药的有效成分含量及体外杀菌效果开展了研究。通常药物有效成分含量可以通过滴定法，可见-紫外分光光度法，免疫学方法，电泳法等方法来测定［1-3］，近年来随着分析仪器的迅速发展，仪器分析在药物研究上应用越来越广泛，其中色谱分析法就以高分离效能、高检测性能、分析快速的特点，成为现代仪器分析方法中应用最广泛的一种方法［4-7］。本研究运用高效液相色谱法（HPLC）对市售不同厂家的恩诺沙星和诺氟沙星共计8种抗菌药物进行了有效成分含量检测；运用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱仪（UPLC-ESI-MS/MS）对不同厂家生产的氟苯尼考共计5种抗菌药物进行了有效成分含量检测。

药物的体外抗菌试验是抗菌药物对细菌抵抗力的一个重要指标，同时也是验证抗菌药物效果的重要依据。肉汤稀释法和琼脂扩散法是药物体外抑菌试验最常用的方法，其中稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，药物的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）可以通过这两种方法来测定。本研究采用了液体培养基连续稀释法对不同厂家恩诺沙星、诺氟沙星及氟苯尼考共计13种抗菌药物进行了MIC和MBC的测定。

1　材料与方法

1.1药物和菌株

本文共选取了浙江主要海水养殖区常用不同厂家的抗菌药物恩诺沙星、诺氟沙星及氟苯尼考等3类抗菌药物共计13种市售渔药（表1）。

试验用菌株为常见海水致病菌——溶藻弧菌，由浙江省淡水水产研究所沈锦玉老师惠赠。

表1　抗菌药物种类Tab.1　Types of antibiotics

1.2喹诺酮类药物的有效成分测定

恩诺沙星和诺氟沙星诺氟沙星标准溶液的配制：准确称取诺氟沙星、氧氟沙星标准品10.0 mg，用0.1 mol/L HCL溶液10 mL溶解，再用乙腈定容于100 mL棕色容量瓶中，此溶液质量浓度为100 μg/mL，于4℃保存备用；根据检测要求用流动相逐级稀释成0.01、0.02、0.05、1.00、2.00 μg/mL标准工作溶液，以各组分的色谱峰面积对质量浓度作线性回归，得定量标准曲线。

药物样品制备：精密称取待测药品约10 mg，置于25 mL容量瓶中，用适量0.1 mol/L的盐酸溶液使之溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀。再精取上述液体20 μL，用乙腈稀释至10 mL供气相色谱测定用。

液相色谱检测条件：色谱柱为Water X Bridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μM）；流动相为四丁基溴化铵（A）+乙腈（B），A∶B=96%∶4%；流速为0.8 mL/min；柱温为40℃；检测器为Waters 2475荧光检测器，激发波长280 nm，发射波长450 nm；进样量为20 μL。

1.3氟苯尼考有效成分测定

氟苯尼考标准溶液的配制：称取适量纯度大于98%的氟苯尼考标准品，用甲醇溶解并定容，配成100 μg/mL的标准储备原液，-18℃避光保存；准确吸取1.0 mL氟苯尼考标准储备原液，用甲醇稀释并定容至100 mL，配成1.0 μg/mL的标准储备液，-18℃避光保存。移取储备液用流动相逐级稀释成0.25、0.50、10.0、20.0、50.0 ng/mL的氟苯尼考标准系列溶液，得定量标准曲线。

样品制备：准确称取待测药品约20 mg，置于25 mL容量瓶中，用适量0.05 mol/L的盐酸溶液使之溶解，用水稀释至刻度，摇匀。再精取上述液体20 μL，用水稀释至1 mL，再取第一次稀释液20 μL，用水稀释至1 mL，供液相色谱-联质谱测定。

液相及质谱检测条件：色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 rnm×50 mm，1.7μM）；流动相：是冬季溴化铵（A）+甲醇（B）；柱温：40℃；进样量：10 μL。

子化模式：电喷雾离子源（ESI），负离子模式；毛细管电压：3.50 kV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：380℃；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔气流量：50 L/h；扫描模式：多反应监测（MRM）；驻留时间：0.15 s。

将标准工作液和样品液等体积进样测定，记录保留时间和峰面积。用Masslynx V4.1工作站对数据进行分析，得到样品制备液的实际测定浓度。

1.4抗菌药物MIC测定

1.4.1渔药原液的制备

根据药物包装所示含量，按照公式计算所需稀释剂用量，用分析天平精确称取抗生素粉剂，使配制的抗菌药物贮存液浓度10倍于最高测定浓度，然后将抗生素粉剂溶解于稀释剂中。

1.4.2菌悬液的制备

挑取细菌培养基上单菌落，满板划线接种于TSA平板，28℃培养24 h，用0.01 M磷酸盐缓冲液洗下培养的菌苔，校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含2×108CFU/mL。

1.4.3最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定

取灭菌试管（13×100 mm）13支，排成一排并编号，在第1管中加入1.6 mL TSB培养液，剩余每管加入TSB 1 mL；在第1管中加入抗菌药物原液0.4 mL混匀，然后吸取1 mL至第2管，混匀后再吸取1mL至第3管，连续倍比稀释至第11管，从第11管中吸取1 mL弃去，第12管为不含药物的空白对照，使各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL。然后在每管内加入上述制备好的菌悬液各1 mL，使第1管至第11管的药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125 μg/mL，每个浓度做3个平行组，将接种好的稀释管，置28℃恒温培养箱中培养，24 h后肉眼观察。以最低药物浓度管中无细菌生长者，为受试菌的MIC。

从MIC测定中未有细菌生长的试管中取100 μL培养液，在TSA平板上涂布均匀，设3个平行对照，28℃恒温培养，24 h后观察有无细菌生长，以无菌生长的最低药物浓度为MBC。

2　结果

2.1喹诺酮类药物有效成分含量检测结果

喹诺酮类药物是水产动物病害防治中使用最广泛的药物，本研究中采用了2010年版《中华人民共和国药典》规定的HPLC法［8］，对市售8种不同商品名的喹诺酮类药物进行了有效成分含量测定，结果按外标法以峰面积计算。检测结果显示，5种恩诺沙星类渔药中只有1种药物含量达到包装所示含量，其余4种均低于所标含量，最低只有标识含量的59.2%，其它在71.2%～83.2%之间。3种诺氟沙星类渔药含量为标识含量的77.2%～100%（图1、表2）。

图1　诺氟沙星的标准曲线图Fig.1　Standard wording curve of Norfloxacin

图2　恩诺沙星标准工作曲线图Fig.2　Standard wording curve of Enrofloxacin

图3　恩诺沙星和诺氟沙星标准品色谱图（1 μg/mL）Fig.3　Chromatogram of Standard sample of Enrofloxacin and Norfloxacin（1 μg/mL）

图4　实际样品检测色谱图Fig.4　Chromatogram of samples

表2　喹诺酮类药物的有效含量测定结果Tab.2　The effective content of quinolone by HPLC

2.2氟苯尼考药物有效成分含量检测结果

共检测了5种不同品牌市售氟苯尼考类渔药，其中三种药物检测含量与药物包装标示含量基本一致，而有两家含量只有包装所示含量的25%。最佳质谱条件和色谱条件下，氟苯尼考药物标准品的标准曲线图和UPLC-ESI-MS/MS色谱图及样品MRM色谱图（图5～7），有效成分含量（表3）。

图5　氟苯尼考标准曲线线性图Fig.5　Standard wording curve of FLR

图6　氟苯尼考标准溶液MRM色谱图Fig.6　MRM chromatogram of FLR standard solution（2.00 ng/mL）

图7　氟苯尼考药物样品测定MRM色谱图Fig.7　MRM chromatogram of Florfenicol samples

表3　氟苯尼考类药物有效成分含量Tab.3　The effective content of florfenicol by UPLC-ESI-MS/MS

2.3MIC与MBC检测结果

所检测的13种常用水产药物，其MBC/MIC值均为1，并且对常见海水致病菌—溶藻弧菌都表现出了较高的敏感性：8种喹诺酮类药物对该菌的MIC和MBC值介于2.28～18.94 mg/L之间；5种氟苯尼考类渔药对受试菌的MIC和MBC值介于0.022～4.48 mg/L之间，其中溶液型氟苯尼考的MIC和MBC值较低，都为0.022 mg/L，显示对受试菌敏感性表现最高（表4）。

表4　抗菌药物对溶藻弧菌的MIC和MBCTab.4　The MIC and MBC values against V.alginolyticus

3　讨论

从世界水产养殖病害防治的发展趋势来看，环境友好型的养殖方式和以免疫制剂为主的免疫防病是今后病害防控的主流方向，但是我国水产养殖尚处于发展阶段，药物防治仍然是控制水生动物疾病的主要手段。从1945年磺胺药成功应用于治疗鳟鱼疖疮病，已有近40种抗菌药物相继应用于水产，目前抗生素依然是防治细菌性病害的首选［9］。恩诺沙星和诺氟沙星是第三代喹诺酮类药物，由于它们对海水养殖常见病原菌如杀鲑气单胞菌、杀鲑弧菌和鲁氏耶尔森菌等具有良好的抗菌活性，被广泛应用于海水养殖细菌性疾病的防治［10］。氟苯尼考是一种化学合成的氯霉素类新型兽用广谱抗菌药物，具有抗菌谱广、吸收良好、体内分布广、无潜在致再生障碍性贫血的副作用和使用安全等特点。同时还填补了由于氯霉素禁用而产生的空白，目前已被广泛应用到水产养殖中［11］。在浙江海水养殖渔用抗生素类药物市场上，恩诺沙星等喹诺酮类药物和氟苯尼考是两类销售比率最高的渔药。但由于缺乏有效的监管机制，目前水产渔药市场还存在很多问题，本研究结果就发现了渔药有效成分含量与药物包装所示含量不一致的情况，含量最低的只有包装所示的25%。渔药中有效成分含量是直接影响临床用药效果的因素之一，因为当渔药有效含量低于包装所示含量，会使推荐浓度下的渔药无法达到疾病防治的效果。有研究认为药物剂量是影响药物效应的重要因素。同一种药物，不同的剂量用于同一个体可能会产生不同的作用。低剂量投药不仅在血液中达不到有效杀（抑）菌浓度，反而造成病原体产生耐药性而使药物失去作用，喹诺酮类药物就是这类浓度依赖性药物［12-13］。本研究调查同时还发现同样成分的渔药有多个产品名，如诺氟沙星又有新白浊克星、渔泰康和蟹病康等商品名。而在海水养殖生产中，当最初使用的药物没有达到预期效果时，不少养殖户往往会通过更换药物来控制疾病，这样的“一药多名”就很容易造成重复用药、过量用药。

最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）是药物抗菌活性的指标，两值的大小代表药物抑杀病原微生物的能力的大小，数值越小则表明抗菌活性越强。研究发现有些药物的MBC值与其MIC值之间非常接近，如氨基糖苷类药物。有些药物的MBC值比MIC值大，如β内酰胺类药物［14］。目前临床医学上用MIC值来反应细菌的耐药性，如果受试药物对供试微生物的MBC≥32倍的MIC，可判定微生物对受试药物产生了耐药性。本文中共测定了13种抗菌渔药对常见海洋致病菌溶藻弧菌的MIC和MBC值，结果，所获的MBC/MIC值均为1。其中药物的MIC值介于0.022～18.94 mg/L之间，说明所测的喹诺酮类和氟苯尼考类药物对该株溶藻弧菌具有优良的抗菌效果。

本研究中获得的不用厂家生产的同类药物产品的MIC和MBC值存在一定差异，究其原因可能有：一是喹诺酮类渔药本身的主要成分存在差异，导致同种药物MIC和MBC值有变化。例如新白浊克星除了含有诺氟沙星成份外还有盐酸小檗碱，而盐酸小檗碱的抗菌谱广，对多种革兰阳性及阴性菌均具抑菌作用；二是药物的水溶性差异，如氟苯尼考与同类抗生素相比水溶性较差［15］。本文中在对市售的氟苯尼考不同厂家的5种抗菌药物进行体外最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）的测定时，直接将粉剂溶于水中来测定MIC和MBC值，获得的5种氟苯尼考类渔药对溶藻弧菌的MIC和MBC值之间存在较大差异，在0.022～4.48 mg/mL之间。溶液型氟苯尼考的MIC和MBC值最低，试验结果说明氟苯尼考在水中的溶解度影响了它的溶出速度，使得所测氟苯尼考药物之间的MIC和MBC值出现了差异。氟苯尼考是新一代氯霉素类合成抗生素，它的活性作用和临床应用均优于氯霉素，因此加强氟苯尼考的水溶性研究有利于推动其在水产养殖业中的应用［16-17］。目前提高氟苯尼考溶解度的固体制剂研究国内已有报道，邓利斌等［18］通过将氟苯尼考与2-羟丙基-β-糊精包合，使氟苯尼考的溶解度增加了35.6倍；洪涛等［19］按不同比例用溶剂法将氟苯尼考与载体PVPK制成了固体分散体，使氟苯尼考溶解度提高为原药的13.0倍。

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Determination of Effective Contents and in Vitro Antibacterial Activities of Thirteen Antibiotics in Mariculture

ZHAO Li1，2，SHI Hui1，LI Pei-pei1，et al
（1.Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Province，Marine and Fishery Research Institute of Zhejiang Ocean University，Key Laboratory of Marine Culture and Enhancement of Zhejiang Province，Zhoushan316021；2.Fishery School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022，China）

In this study effective drug contents of eight quinolones and five florfenicols in mariculture were determined by high-performance liquid chromatography coupled with fluorescence（HPLC）and ultraperformance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry（ΜPLC-ESI-MS/MS）.The results showed that many antibiotics of commonly used the actual effective drug contents do not match the packaging. Only four kinds of quinolones effective drug contents are consistent with the packaging marked，the lowest effective content is only fifty-nine point two percent of marked.Three kinds of florfenicol effective contents are consistent with the packaging marked，the other two kinds of florfenicol effective drug contents are onlytwenty-five percent of marked.Minimal inhibitory concentrations（MIC）and minimal bactericidal concentrations （MBC）of thirteen drugs such as florfenicol and so on against marine pathogenic Vibrio alginolyticus were determined by tube dilution method.The results demonstrated that the antibacterial activities of florfenicol against Vibrio alginolyticus are similar to those of quinolone.MIC and MBC values against Vibrio alginolyticus are in the range 2.28-18.94 mg/L for quinolone，0.022-4.48 mg/L for florfenicol.

quinolone；florfenicol；HPLC；ΜPLC-ESI-MS/MS；MIC；MBC

S948

A

1008-830X（2015）02-0167-07

2014-12-10

浙江省科技厅项目（2012F30022；2015F30003；2015F10001；2015F50004）

赵莉（1987-），女，浙江嘉兴人，硕士，研究方向：海水养殖病害.Tel:18505731015；E-mail:823226934@qq.com

施慧.E-mail:huishi2002@126.com