RP-HPLC法测定暴马丁香中齐墩果酸的含量

王　化，李梦莎，朱良玉，周丽萍

RP-HPLC法测定暴马丁香中齐墩果酸的含量

王化，李梦莎，朱良玉，周丽萍

（黑龙江省科学院自然与生态研究所，哈尔滨 150040）

建立反相高效液相色谱法测定暴马丁香中齐墩果酸含量的方法。采用Waters C18色谱柱，流动相为甲醇-0.5%磷酸水溶液（82∶18），流速为1.0 mL/min，检测波长为205 nm。齐墩果酸进样浓度在0.01～1.0 mg/mL线性关系良好（R2=0.9998）；平均回收率为101.3%（RSD=1.7%）。本法准确、可靠，灵敏度高，可作为暴马丁香中齐墩果酸的定量分析方法。

暴马丁香；齐墩果酸；高效液相色谱法

暴马丁香（Syringa reticulata），木犀科，丁香属，温性树种，适应性强，栽培历史悠久。在我国境内主要分布于黑龙江省东部山区和小兴安岭地区，吉林省东部山区和辽宁省丹东、宽甸、凤城等地［1］。暴马丁香不仅具有美化环境的作用，还具有良好的药用价值，全株可入药［2］。从暴马丁香枝叶中共分离出40余种成分，主要有紫丁香苷、橄榄苦苷、齐墩果酸、山奈酚、槲皮素等［3-4］，经现代药理学实验已证明：暴马丁香有清肺、祛痰、平喘、止咳、消炎、利尿等功效［5］，以其为原料生产的芩暴红止咳片、胶囊对治疗急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、感冒咳嗽等症均具有较好疗效［6］。在抗菌、保肝和抗氧化等方面，暴马丁香也表现出较好的活性［7］。因此，研究及分析暴马丁香中的活性物质对暴马丁香的基础研究和开发应用具有重要意义。

齐墩果酸（Oleanolic acid）属五环三萜类化合物，有护肝降酶、抗菌、抗肿瘤、强心利尿等药理作用，用于急、慢性肝炎辅助治疗［8-9］。齐墩果酸结构复杂，不易人工合成，因此主要从植物中提取得到。虽然齐墩果酸是暴马丁香的重要活性成分之一，但暴马丁香中齐墩果酸的含量测定未见文献报道。本文采用RP-HPLC法对暴马丁香中齐墩果酸的含量进行了方法学研究，为进一步开发、利用暴马丁香资源提供了科学依据。

1　仪器与试药

Waters e2695-2998液相检测系统；齐墩果酸对照品（≥98%）购自天津一方科技有限公司；2014年5月采集暴马丁香枝条、叶片样品于60℃烘干至恒重，粉碎，过筛40目，于阴暗干燥处储存、备用；甲醇（色谱纯），无水乙醇（分析纯），超纯水自制。

2　方法与结果

2.1溶液的配制

2.1.1对照品溶液

精密称定齐墩果酸对照品，加70%乙醇制成齐墩果酸浓度为1mg/mL的溶液作为对照品储备液。

2.1.2供试品溶液

暴马丁香原料粉碎，过40目筛，称取细粉1.00g，置于烧杯中，加入70%乙醇20mL，放入超声波提取器中提取1.0h，过滤，取滤液为供试品溶液。

2.2色谱条件

色谱柱为WatersC18（150mm×4.6mm，5μm）柱；流动相为甲醇-0.5%磷酸溶液，梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；检测波长为205nm；进样量为10μL。色谱图见图1。

图1　对照品（A）及样品（B）HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms ofreference substance（A）and sample（B）

2.3线性关系试验

精密量取对照品的储备液，加入浓度为70%的乙醇，配制浓度为0.01mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的对照品溶液，以齐墩果酸浓度（mg/mL）为横坐标（X），以HPLC检测峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=6 437 809.91X-42 429.80，R2=0.999 8。结果表明：齐墩果酸浓度在0.01～1.0 mg/mL线性关系良好（如图2所示）。

图2　齐墩果酸标准曲线Fig.2 Standard curve of oleanolic acid

2.4精密度试验

对照品溶液6次重复进样，每次进样体积10μL，记录峰齐墩果酸面积数值。求得其峰面积的RSD为0.2%，表明精密度良好。

2.5重复性试验

取暴马丁香细粉，按“2.1.2”项所述方法操作，制备6份平行供试品溶液，按上述色谱条件分别测定，结果齐墩果酸含量的平均值 （n=6）为0.24%，RSD为3.2%，表明重复性良好。

2.6稳定性试验

取新制同一供试品溶液，于室温下放置，在0h、2h、4h、6h、8h、12h分别进样10μL，记录齐墩果酸峰面积，计算得到其峰面积的RSD为0.3%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.7回收率试验

取已知齐墩果酸含量 （0.24%）的暴马丁香细粉约0.1g，共6份，精密称定后，分别加入浓度为0.5mg/mL齐墩果酸对照品2mL，制备所需溶液，每个溶液进样量10μL，记录齐墩果酸峰面积，计算得到平均回收率（n=6）为101.3%（RSD=1.7%），表明本方法准确性较好。

2.8样品测定

分别称取暴马丁香枝条、叶片样品粉末，按照“2.1.2”项方法制备供试样品溶液，按“2.2”项色谱条件进行测定，每个样品重复3次。记录样品峰面积，计算齐墩果酸含量，结果见于表1中。

表1　样品测定结果Tab.1　Results of sample determination

3　讨论

第一，试验所采用色谱条件的线性关系、重复性、稳定性、加样回收率良好，方法可行。

第二，试验所采用色谱条件检测灵敏度高，峰形对称，且在20 min内可对所有色谱峰检测完毕，说明该方法灵敏度高、节省时间及溶剂使用量。

第三，试验结果表明：暴马丁香枝条中齐墩果酸的含量高于叶片中含量，在工业生产中，基于提高生产效率原则，可更多的考虑以暴马丁香枝条作为原料。关于暴马丁香枝条中齐墩果酸含量的时空动态变化比较还在进一步的研究中。

［1］崔洪霞，蒋高明，臧淑英.丁香属植物的地理分布及其起源演化［J］.植物研究，2004，24（2）：141-145.

［2］蔡恩博.长白山暴马丁香树皮化学成分及药理活性的研究［D］.长春：吉林农业大学，2012.

［3］ 徐国兴.长白山暴马丁香枝化学成分的研究［D］.长春：吉林大学，2003.

［4］ 宋光西，马玲云，魏锋，等.暴马子皮化学成分研究［J］.中国药学杂志，2012，47（24）:1979-1982.

［5］蔡恩博，张崇禧，朱启光，等.星点设计-效应面法优选暴马丁香树皮中紫丁香苷的提取工艺［J］.药物分析杂志，2011，31（9）：1808-1811.

［6］ 李辉.芩暴红胶囊质量评价及用3D-HPLC谱鉴别中药的研究［D］.沈阳：沈阳药科大学，2002.

［7］ 张崇禧，蔡恩博，陈艳，等.暴马丁香抑菌活性、抗氧化作用研究及微量元素的测定［J］.食品科学，2010，31（7）：131-134.

［8］ 唐初，陈玉，柏舜，等.齐墩果酸的结构修饰与生物活性研究进展［J］.有机化学，2013，（33）：46-65.

［9］ 张蜀艳，李政.齐墩果酸研究进展［J］.食品与发酵科技，2010，46（4）：20-24.

RP-HPLC determination of oleanolic acid in Syringa reticulata

WANGHua，LI Meng-sha，ZHULiang-yu，ZHOULi-ping
（Institute ofNatural Resources and Ecology，HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150040，China）

This paper aims to develop a RP-HPLC method for the determination of oleanolic acid in Syringa reticulate.A Waters C18 column was adopted.The mobile phase was a mixture of methanol-0.5%phosphoric acid solution（82:18）.The flow rate was 1.0 mL/min，UV detection wave length was at 205nm.A good linearity was obtained in the range of 0.01-1.0 mg/mL for oleanolic acid.The average recoveries was 101.3%（RSD=1.7%）.This method is simple，accurate，sensitive and suitable for the determination ofoleanolic acid in Syringa reticulate.

Syringa reticulate；Oleanolic acid；HPLC

R927.2

A

1674-8646（2015）04-0054-02

2015-03-25

王化（1981-），女，吉林大安人，助理研究员，博士，从事天然产物研究。