探讨益肝降脂方对大鼠酒精性脂肪肝病理影响与疗效的相关性*

李全征，赵远红，李　正，贾英杰，左晓娜，韩素恒，徐　雨，尹纪红

探讨益肝降脂方对大鼠酒精性脂肪肝病理影响与疗效的相关性*

李全征1，赵远红2，李正3，贾英杰3，左晓娜1，韩素恒1，徐雨1，尹纪红1

（1.天津中医药大学研究生院，天津300193；2.天津中医药大学第一附属医院肿瘤科，天津300193；3.天津中医药大学第一附属医院制剂室，天津300385）

［目的］通过观察肝脏组织形态学的改变以探讨求证益肝降脂方（YGJZF）对酒精性脂肪肝大鼠肝组织病理的影响及分析。［方法］实验共分为3期，共245只雄性SD大鼠分为3个大组：空白组15只、模型组50只、中药组180只。统一采用高脂饲料+乙醇灌胃法建立大鼠酒精性脂肪肝模型，并分别予以相应中药干预，获取各组大鼠肝脏同一位置组织制作苏木精-伊红（HE）染色病理切片，观察3组大鼠肝脏组织形态学的变化。［结果］中药各组大鼠肝组织损伤程度均较模型组轻，且两者存在显著差异性（P＜0.05）。［结论］YGJZF能够减轻酒精性脂肪肝大鼠肝组织的病理损伤，对酒精性脂肪肝有肯定的保护作用。

益肝降脂方；酒精性脂肪肝；肝组织病理

近年来，随着人们饮食结构的改变和饮酒消费的日益增长，酒精性脂肪肝在中国的发病率越来越高，且日趋低龄化［1］。数据统计结果发现，世界上1 500～2 000万的酗酒人群中约有10%～20%发生了不同程度的酒精性脂肪肝［2］。目前研究认为，乙醇及其代谢产物乙醛等可以直接或间接损害肝细胞，引发肝细胞脂肪变性和酒精性肝炎等，而这些病理改变常常是比较隐匿，一旦迁延至肝纤维化、肝硬化，其预后较差，严重危害人们的健康。因此，酒精性肝病的早期干预治疗有着极其重要、广泛的现实意义。而现代医学对酒精性肝病除戒酒、对症治疗外，尚无特效规范的疗法。

在长期临床中，课题组发现中医药在治疗酒精性肝病方面具有独特的优势，其“升清降浊解郁法”指导下的益肝降脂方经前期临床与实验证实［3］具有较好的防治酒精性肝病作用。本文通过观察分析益肝降脂方对3期实验中各组大鼠肝脏组织病理改变的影响，探究中药复方对酒精性脂肪肝的病理影响，并结合前期实验结果，进行数据分析与判读。

1　材料

1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠共245只，体质量180～220 g，由中国人民解放军军事医学科学院提供，动物许可证：SCXK-（军）2007-004，饲养于天津中医药大学第一附属医院实验动物房。

1.2药物及制备56°牛栏山二锅头，由北京顺鑫农业股份有限公司生产；高脂饲料（1%胆固醇、10%猪油、0.3%胆酸钠、8%蛋黄粉、80.7%基础饲料）由中国医学科学院放射医学研究所制作；益肝降脂方（黄芪、黄连、葛根、丹参、水红花子、苏叶）由天津市中医药大学第一附属医院制剂室按比例制成，含生药1.33 g/mL的浸膏灌胃液。

1.3主要仪器和设备QP3268轮转式石蜡切片机、帆船7101玻璃载玻片、凤凰XSP-35TV 1 600倍生物实验显微镜。

2　方法

2.1动物模型建立根据研究目的实验共分析3期，雄性SD大鼠245只，均经预适应饲养（普通基础饲料+自由进食饮水+少量生理盐水灌胃）1周后，按照随机数字表法分为3组：空白组15只，模型组50只，中药组180只（其中中药1组75只，中药2组60只，中药3组45只）。除空白对照组饲以普通饲料外，模型组及中药组均采用高脂+乙醇灌胃法建立酒精性脂肪肝模型：大鼠每周测体质量1次，并按1.5mL/100g乙醇每日早晚进行灌胃（时间间隔8h以上），所用乙醇其体积分数第1～4周为40%，第5～8周为45%，第9～12周为50%（适应性饲养不计入实验周）。中药1、2、3组分别于第3、6、9周起，乙醇灌胃后0.5h，予中药浸膏灌胃（按每只2.66 g，分2次），相应的，从第3周起模型组予以生理盐水灌胃。

于第6周末、第9周末、第12周末分批取材：第6周末模型组共取12只（以下记模型A组），中药1组共取12只（以下记中药1A组）。第9周末模型组共取12只（以下记模型B组），中药1组共取12只（以下记中药1B组），中药2组共取12只（以下记中药2B组）。第12周末将剩余大鼠全部取材（分别记以空白组，模型C组，中药1C、2C、3C组）。随机抽取各组大鼠，禁食水12h后称质量，用乙醚麻醉并目内眦取血约5mL，脱颈处死后即取出肝脏。取部分肝右叶放于10%中性福尔马林溶液中固定，留作病理切片。在左肝叶取约1 cm×1 cm肝组织块以锡纸包裹存放于冰箱备份。血液样本经3 000 r/min离心取血清备用。

2.2观察指标及测定方法

2.2.1一般情况观察实验中大鼠的精神状况，毛发光泽度、活动情况、食量、体质量、大小便及死亡情况等。

2.2.2病理学观察肉眼观察：包括肝脏大小、色泽、质地、边缘情况；镜下观察：10%中性福尔马林溶液固定的肝组织，石蜡包埋，6μm切片，苏木精-伊红（HE）染色后观察大鼠肝脏病理学改变，按2010年中国医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组修订的《酒精性肝病诊疗指南（2010年1月修订）》［4］进行纤维化程度（S）分级，与肝细胞脂肪样变与坏死等的程度判定。

2.2.3统计学处理应用SPSS 18.0通用软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结果

3.1一般情况空白组大鼠精神状态较好，灌胃时较温顺，皮毛光泽，行动灵活，进食及大便正常；模型组大鼠精神不振，毛发粗糙，染毒时挣扎，醉酒现象明显，进食量较空白组少，大便溏泄；中药组大鼠精神尚可，毛发光泽度较差，染毒时较配合，醉酒现象较模型组轻，进食量正常，大小便正常。实验结束时，模型组大鼠死亡3只，中药组死亡11只，其中中药1组死亡6只，中药2组死亡3只，中药3组死亡2只，可能与反复饲喂或实验人员灌胃不慎呛咳反流入气管有关。各组大鼠体质量情况见表1。

3.2不同时段肝脏组织病理形态学表现见表2和表3。

表1　各组大鼠体质量对比（±s）Tab.1　Com parison of ratsbody weight in each group（±s）g

表1　各组大鼠体质量对比（±s）Tab.1　Com parison of ratsbody weight in each group（±s）g

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型A组比较，☆P＞0.05；与模型B组比较，◆P＜0.05；与模型C组相比，▲P＜0.05；与中药1B组比较，★P＜0.05；与中药1C组比较，※P＜0.05。

组别　　预饲养后　3周末　6周末　9周末　12周末空白组　217.0±11.5　317.0±19.8　323.0±38.2　346.0±40.2　364.0±41.6模型A组　217.0±12.2　351.0±33.3　435.0±37.5　-　-中药1A组　218.0±11.4☆　354.0±32.5☆　438.0±38.3☆　-　-模型B组　216.0±13.6　349.0±31.7　433.0±37.6　451.0±41.6　-中药1B组　217.0±12.6◆　352.0±30.2◆　434.0±36.9◆　454.0±40.7◆　-中药2B组　216.0±12.9★◆　350.0±32.8★◆　436.0±35.8★◆　452.0±39.8★◆　-模型C组　217.0±12.3#　352.0±31.5#　434.0±37.2#　452.0±40.5#　465.0±43.1#中药1C组　219.0±11.7#▲　349.0±32.6#▲　432.0±35.7#▲　453.0±41.8#▲　467.0±44.2#▲中药2C组　218.0±12.4#▲※　353.0±30.4#▲※　437.0±34.3#▲※　451.0±42.3#▲※　465.0±45.1#▲※中药3C组　218.0±11.9#▲※　352.0±31.7#▲※　434.0±33.4#▲※　453.0±42.1#▲※　468.0±44.7#▲※

表2　各组大鼠肝脏组织学表现Tab.2　The ratshistologym anifestationsof liver tissue

表3　各组大鼠纤维化分期情况Tab.3　Hepatic fibrosisstaging of rats in each group

3.2.1肉眼观察空白组肝脏颜色鲜红，表面明亮光滑，无结节形成，边缘锐利，各叶比例大小均正常，包膜不紧张，质韧；模型组肝脏呈土黄色，表面暗淡，有的可见大小不等的结节，各叶比例大小是均衡，边缘钝，包膜紧张，质硬；中药组肝脏色暗略带黄色，边缘稍钝，与模型组相比结节少见，各叶比例大小接近空白组，包膜不紧张，质稍硬。

3.2.2HE染色镜下观察

3.2.2.1空白组肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐，以中央静脉为中心呈放射状排列。肝细胞呈多边形，核大而圆，位于肝细胞中央。肝窦内及汇管区可见少量淋巴细胞浸润，无纤维组织增生。见图1。

图1　空白组（HE染色×100）Fig.1　Theblank group（HE staining×100）

3.2.2.2模型C组肝小叶结构紊乱，肝细胞普遍变性，胞浆疏松，呈气球样变，肝血窦变狭窄，可见广泛的脂肪变性，并有散在点状坏死、桥接坏死甚至大片状坏死，坏死灶及汇管区淋巴细胞浸润，肝细胞再生较活跃，核大、深染，汇管区明显增宽，大量的成纤维细胞、纤维细胞，增生的胶原纤维自中央静脉及汇管区向周围延伸，包绕肝小叶，并分割肝小叶而形成假小叶，肝血窦周围可见纤维组织增生。见图2。

图2　模型C组（HE染色×100）Fig.2　ThemodelC group（HE staining×100）

3.2.2.3中药1C组肝小叶结构规则，肝细胞成多边形，排列较整齐，脂肪变性集中在3区，以大泡型为主，小脂滴数量较少，可见少量点状坏死，纤维间隔较少，汇管区少量炎性细胞浸润。见图3。

3.2.2.4中药2C组肝小叶结构较规则，可见肝细胞体积增大，肝血窦变窄，多见混合型的脂肪变性，中央静脉周围肝细胞再生活跃，核大，胞脂深染，可见少量嗜酸性变、点状坏死，汇管区可见大量炎性细胞浸润及纤维增生。见图4。

图3　中药1C组（HE染色×100）Fig.3　The YGJZF 1C group（HE staining×100）

图4　中药2C组（HE染色×100）Fig.4　TheYGJZF 2C group（HE staining×100）

3.2.2.5中药3C组肝小叶结构不规则，肝细胞体积增大，胞浆淡染，染色质呈颗粒状，甚至呈气球样变，肝血窦变窄，可见广泛的混合型脂肪变性，中央静脉周围肝细胞再生活跃，核大，散在点状坏死甚至桥接坏死，汇管区可见大量炎性细胞浸润及纤维增生，有假小叶形成。见图5。

4　讨论

2012亚太肝病年会纪要［5］强调乙醇是许多疾病包括肝癌的危险因素。长期大量饮酒可导致肝脏组织病理不同程度的改变，包括脂肪变性、肝细胞肿胀坏死、肝细胞凋亡、炎症细胞浸润、肝纤维化等。酒精肝诊断的“金标准”是肝组织的病理变化［4］，从轻症酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎及肝纤维化到肝硬化有其特征性病理改变，因此本实验通过模拟人类日益严重的长期大量饮酒、高脂饮食的不良生活模式，采用成熟的造模方法［6］从肝组织病理学结果证明SD大鼠酒精性脂肪肝造模成功及可重复性，比对分析中药的干预效果。

图5　中药3C组（HE染色×100）Fig.5　The YGJZF 3C group（HE staining×100）

酒精性肝病病因明确但发病机制复杂，目前尚未完全清楚，一般认为与乙醇及其代谢产物对肝脏的毒性作用、氧化应激、免疫介导、细胞因子、细胞凋亡、内毒素［7］、以及病毒的叠加、遗传等多种因素有关［8］。目前广为接受的理论是Day等［9］提出的“二次打击”学说。研究表明，氧化应激和脂质过氧化作用在酒精性肝病的发生、发展中起着重要的作用［10］。课题组前期实验中［11-14］，通过对酒精性脂肪肝大鼠丙二醛（MDA）、黄嘌呤氧化酶（XO）［15］、异前列腺素（8-iso-PGF2α）表达的检测，发现益肝降脂方具有明确的降低三者的作用，从而推断益肝降脂方的保护机制，可能与其抗过氧化作用［16］有关。

众所周知，肝组织活检不仅能明确诊断，正确区分单纯性脂肪肝亦或脂肪性肝炎，同时也可对肝组织进行分级分期［17］。通过对大鼠肝脏组织病理染色，记录观察各组SD大鼠酒精性脂肪肝变性和肝纤维化的分期分级，更直观的反映出益肝降脂方对酒精性脂肪肝大鼠肝组织的影响。结果显示：模型组大鼠酒精性肝病病理损伤呈现逐渐进展的趋势，随造模时间延长肝组织脂肪变进行性加重。而中药组肝组织损伤较模型组轻，且进展缓慢。通过中药各组组间对比，发现中药干预时间越早，肝损伤程度越轻，其疗效与病理损伤呈现出相关性。

通过对3期实验的肝组织病理学全面分析，证实益肝降脂方具有明显的拮抗酒精肝病理损伤的作用，与评价氧化应激和脂质过氧化的特异标志物8-iso-PGF2α活性表达呈现出趋势上的平行一致［18］。

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［3］赵远红，贾英杰，董承超，等.益肝降脂方预处理对早期酒精性肝损伤的保护作用研究［J］.天津中医药，2010，3（1）：1672-1519.

［4］中国医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊疗指南 （2010年1月修订）［J］.现代医药卫生，2011，27（6）：801-804.

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（本文编辑：马英，高杉）

Investigation on the correlation of the effectof Y igan Jiangzhi Fang on pathology in ratsw ith alcoholic fatty liver

LIQuan-zheng1，ZHAOYuan-hong2，LIZheng3，JIAYing-jie2，ZUOXiao-na1，HANSu-heng1，XUYu1，YIN Ji-hong1
（1.DepartmentofPostgraduate，Tianjin University of TraditionalChinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.DepartmentofOncology，The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China；3.DrugManufacturingRoom，The First Affiliated Hospitalof Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300385，China）

［Ob jective］To observe themorphological changes of liver tissue in order to discuss and verify the pathology effects on liver tissue of Yigan Jiangzhi Fang（YGJZF）on alcoholic fatty liver in rats.［M ethods］The experimentswere divided into 3 stages.A totalof 245male SD ratswere random ly divided into 3 groups:blank group 15，model group 50，YGJZFgroup 180.Ratswere given fat dietand alcohol feeding to establish alcoholic fatty livermodel，and were separately corresponding intervention，rats in each group were stained with HE tomake pathologicalslicesat the same position of liver tissue，observed the changesofmorphological liver tissue of three groups of rats.［Results］The degree of rats liver tissue injury in YGJZF group was lighter than in themodel group，and the difference was statistically significant.［Conclusion］YGJZF can reduce the pathological injury of liver tissue ofalcoholic fatty liver in rats，hasa positive protection effecton alcoholic fatty liver.

Yigan JiangzhiFang；alcoholic fatty liver；hepatic tissue pathology

R575.5

A

1672-1519（2015）02-0093-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.02.08

天津市应用基础及前沿技术重点项目（11JCZD JC19900）。

李全征（1987-），硕士研究生，主要研究方向为常见肝病（肿瘤）的临床与实验研究。

赵远红，E-mail:yuanhongzh98@163.com。

（2014-10-11）