LC-MS法测定大鼠血浆中甘草次酸及其药动学研究*

王兴蕊，欧阳慧子，窦　婷，薄　芳，屠亚茹，何　俊

（1.天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室，天津300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

·中药研究·

LC-MS法测定大鼠血浆中甘草次酸及其药动学研究*

王兴蕊1，欧阳慧子2，窦婷，薄芳1，屠亚茹1，何俊1

（1.天津中医药大学中医药研究院，天津市现代中药重点实验室，天津300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

［目的］建立液相色谱-质谱联用（LC－MS）的方法测定大鼠口服三拗汤后甘草次酸的药代动力学。［方法］采用Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-水（含10 mmol/L甲酸铵），90%乙腈等度洗脱，流速0.3 mL/min，柱温25℃，进样量20 μL。采用电喷雾离子源，SIM负离子检测模式，甘草次酸和熊果酸（内标）定量离子分别为m/z 469.4和m/z 455.4。大鼠单剂量灌胃给予三拗汤浓缩液后，经液-液萃取法对大鼠血浆样品进行预处理，利用LC-MS法测定大鼠体内甘草次酸的血药浓度，并采用DAS（ver．1．0）软件计算药代动力学参数。［结果］甘草次酸的线性范围为5～10 000 μg/L，最低定量限为5 μg/L，内源性物质不干扰甘草次酸及内标的测定，方法精密度、准确度、回收率和稳定性均符合生物样品的测定要求。［结论］本方法具有专属性强、准确度高、灵敏度好的特点，可用于甘草次酸的药代动力学研究。

三拗汤；甘草次酸；药物代谢动力学

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.10

三拗汤出自张仲景撰写的《金匮要略》，方药主要由麻黄、杏仁和甘草3种成分组成，具有宣肺解表、止咳平喘的功效，可用于治疗外感风寒、肺气不宣、头痛目眩、痰多咳嗽等症［1-7］。方中甘草具有祛痰、止咳等作用，其主要化学成分有甘草酸、甘草多糖及甘草黄酮等，其中甘草酸具有清热解毒、润肺止咳等作用［8-11］，为甘草的药效成分，其在生物体内主要转化为甘草次酸。甘草次酸具有中枢性镇咳作用，此外，还有抗肿瘤以及抗病毒感染的作用［12-14］。因此，本实验建立了液相色谱-质谱联用（LC－MS）的方法测定大鼠血浆中甘草次酸的血药浓度，并对大鼠灌胃给予三拗汤浓缩液后甘草次酸的药代动力学进行了研究。

1　仪器与材料

1.1仪器API 3200三重四级杆质谱仪（配备电喷雾离子源、Analyst Software数据处理系统）；Agilent 1200高效液相色谱仪；梅特勒-托利多AX 205分析天平（瑞士）；XW-80 A型微型涡旋混匀器（上海沪西分析仪器厂）；高速离心机（Beckman）；KQ-250 E型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；超纯水系统（Millipore）。

1.2材料甘草次酸（购自中国食品药品检定研究院，批号MUST-14082210，纯度≥98%）；熊果酸标准品（购自中国食品药品检定研究院，批号110742-200415，纯度≥98%）；乙腈（色谱纯，购自Fisher公司）；甲醇（色谱纯，购自TEDIA公司）；甲酸铵（分析纯，购自天津市天河化学试剂厂）；乙酸乙酯（分析纯，购自天津凯信化学工业有限公司）；超纯水为Milli-Q制备。

1.3动物雄性SD大鼠8只，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号0163041。

2　方法与结果

2.1色谱条件AgilentZorbaxSB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，Agilent Zorbax C18（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）保护柱；流动相：乙腈-10 mmol/L甲酸铵水溶液（90∶10；V/V），流速：0.3 mL/min，等度洗脱，柱温：25℃，进样量：20 μL。

2.2质谱条件电喷雾离子源（ESI源），SIM负离子检测模式。Curtain Gas为15 psi；IonSpray Vottage为-4 500 V；Temperature为350℃；GS1为40 psi、GS2为60 psi；甘草次酸的定量离子为m/z 469.4，DP为-85.5；EP为-10；熊果酸（内标）的定量离子为m/z 455.4，DP为-88.2；EP为-10。

2.3对照品及内标溶液的配制精密称取甘草次酸标准品5.0 mg和熊果酸标准品5.0 mg，分别采用甲醇溶解定容于25 mL容量瓶中，作为储备液。精密吸取一定量的甘草次酸储备液用乙腈稀释为10 mg/L的工作液，同样，采用乙腈稀释熊果酸储备液为400 μg/L的工作液。所有的储备液和工作溶液均保存在-20℃的冰箱中。

2.4供试品溶液的制备分别称取麻黄、杏仁、甘草各9 g，加入220 mL蒸馏水，煎煮60 min后将药液滤出，剩余药渣加水160 mL继续煎煮60 min，合并药液并浓缩至18mL，储存于-20℃冰箱中备用。

2.5血浆样品处理方法精密量取血浆样品100 μL，依次加入100 μL乙腈，100 μL内标溶液（400 μg/L的熊果酸溶液），800 μL乙酸乙酯，涡旋2 min，12 000 g离心5 min，吸取上清液900 μL，40℃水浴氮气吹干，采用流动相100 μL复溶，超声1 min，13 000 g离心5 min，吸取上清液，20 μL进行LCMS分析。

2.6方法学考察

2.6.1专属性考察精密量取6份100 μL空白血浆，除不加内标外，其他按“2.5”项下处理并吸取上清进样分析，得色谱图A。另取6份100 μL空白血浆，配制成含100 μg/L甘草次酸，依同法处理并吸取上清进样分析，得色谱图B。取大鼠给药后血浆样品依同法处理并吸取上清进样分析，得色谱图C。其中甘草次酸和内标熊果酸的保留时间分别为3.21 min和4.79 min。结果表明，空白血浆中内源性杂质不干扰甘草次酸和内标的测定。见图1。

2.6.2精密度与准确度精密量取100 μL大鼠空白血浆，加入甘草次酸对照品溶液适量，配制成含甘草次酸浓度为10、100、1000μg/L的低、中、高3个浓度的质控样品（QC）各5份，按“2.5”项下方法处理，连续测定3 d，与标准曲线同时进行测定，记录甘草次酸的峰面积，计算QC样品的测定浓度，与配制浓度对照，求得方法的准确度，并计算方法的日内、日间精密度。结果甘草次酸的日内精密度RSD值分别为4.1%、1.8%、7.2%；日间精密度RSD值分别为4.8%、1.9%、5.2%，所得结果均小于15%，符合生物样品的测定要求。结果见表1。

表1　大鼠血浆中甘草次酸的日内、日间精密度与准确度（n=5）

图1　LC-MS法色谱图

2.6.3提取回收率精密吸取100 μL空白血浆，分别加入100 μL低、中、高3种浓度的甘草次酸对照品溶液，按“2.5”进行处理与测定，测得甘草次酸峰面积与未经提取直接进样测定的低、中、高3个浓度的甘草次酸对照品溶液比较，每个浓度平行操作5份，则甘草次酸低、中、高浓度的提取回收率分别为（79.0±1.2）%、（66.6±1.2）%、（66.4±1.8）%，其RSD值分别为1.6%、1.8%、2.6%。

2.6.4基质效应精密量取100 μL空白血浆，除不加内标外，按“2.5”项下处理操作，取上清并分别加入一定量的低、中、高3个浓度的甘草次酸对照品及内标溶液各3份，并进行测定，其甘草次酸的峰面积与相同浓度的甘草次酸对照品溶液峰面积比较，得甘草次酸低、中、高3个浓度基质效应分别为（105.9±4.9）%、（101.2±3.2）%、（103.2±5.8）%；内标熊果酸的基质效应为（96.3±3.9）%，结果在85%～115%之内。表明本方法测定条件下血浆中内源性杂质对甘草次酸的测定基本没有影响。

2.6.5稳定性实验精密量取100 μL空白血浆，分别配制为低、中、高3种浓度的血浆样品各3份，按“2.5”项下处理分析，分别考察了甘草次酸在室温条件下放置0、12、24 h，-20℃冰箱冷冻放置0、3、7 d，反复冻融1、2、3次的稳定性。测定结果的准确度在96.5%～113.6%之间，RSD值均小于15%。表明甘草次酸在上述条件下处理稳定性良好。

2.7药动学研究取8只SD雄性大鼠，于给药前禁食12 h以上，饮水自由。大鼠灌胃给予三拗汤全方浓缩液，给药剂量为9 mL/kg，分别于给药前及给药后1、2、3、4、5、6、8、10、11、12、13、24、36、48 h经大鼠眼底静脉丛取血0.3 mL，置已肝素化的离心管中，4 000 g离心10 min，取血浆100 μL按“2.5”处理并进样，测定血药浓度，绘制平均药时曲线，结果见图2。采用DAS（ver．1．0）软件进行房室模型拟合并计算甘草次酸的药动学参数，结果见表2。

表2　大鼠给药三拗汤后甘草次酸药动学参数（±s）

表2　大鼠给药三拗汤后甘草次酸药动学参数（±s）

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3　讨论

实验采用电喷雾离子源，对GS1、GS2、DP和EP等参数进行了优化［15］。对甘草次酸进行一级质谱全扫描时，主要获得其去质子化的准分子离子峰［M-H］-峰，在不同的碰撞能量下甘草次酸的二级质谱可产生m/z 425.2和m/z 355.3的碎片离子峰，但强度较弱。在实际血浆样品测定时采用一级离子检测即可，血浆样品在甘草次酸出峰处无干扰，且离子响应好。内标物熊果酸在对其进行一级质谱全扫描时，主要获得其去质子化的准分子离子峰［M-H］-峰，熊果酸较难裂解成二级离子。故实验选用SIM扫描方式对甘草次酸进行定量测定。

血浆样品采用甲醇或乙腈沉淀蛋白，或沉淀蛋白后氮气吹干的方法都会对甘草次酸产生干扰［16］，且固相萃取检测成本较高。所以本实验最终采用液-液萃取法对甘草次酸的血浆样本进行预处理，简单萃取后即可达到实验测定要求［17］。

甘草中甘草酸是含量最高的苷类化合物，主要由顺式甘草酸和少量反式甘草酸组成［18-19］。在生物体内甘草酸经胃酸水解或经β-葡萄糖醛酸酶分解成甘草次酸。甘草次酸可在肝肠循环中经肠内菌作用而发生药物活性，其活性较甘草酸更强。甘草次酸具有广泛的药理作用，包括抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗心律失常以及肾上腺皮质激素样作用［20-22］。实验结果表明，大鼠灌胃三拗汤浓缩液后，甘草次酸在大鼠体内的药动学过程符合一室模型，并于给药后10～13 h后达峰，且消除缓慢，给药后48 h后仍能检测得到。

图2　大鼠单次灌胃给药三拗汤浓缩液后甘草次酸血浆药物浓度时间曲线（n=8）

［1］杨翀，梁光义，曹佩雪，等.三拗汤不同配伍中麻黄碱、甘草酸和苦杏仁苷的变化［J］.中草药，2008，39（3）：372-375.

［2］阎丽娟，李媛媛，陈爽白.浅谈麻黄的功效［J］.天津中医药，2011，28（4）：317-319.

［3］陈慧.三拗汤加减治疗小儿寒饮停肺型哮喘临床观察［J］.天津中医药，2006，23（1）：29-30.

［4］张灿玾.感冒病证治浅见［J］.天津中医药，2010，27（1）：1-4.

［5］黄国庆.浅谈四时感冒的辨证施治［J］.天津中医药，2011，28（1）：52-53.

［6］卓玉珍，赵连根，刘俊红，等.桃仁及苦杏仁提取液的高效液相分析及其毒性比较研究［J］.天津中医药，2009，26（6）：500-502.

［7］王昭杰，赵政，刘贵颖.哮病痰论［J］.天津中医药，2007，24（4）：306-307.

［8］张利.甘草的药理作用及现代研究进展［J］.中医临床研究，2014，6（10）：147-148.

［9］金海浩.炙甘草汤古今运用比较［J］.天津中医药，2010，27（3）：223-225.

［10］李佳，宋新波，余保林，等.高效液相色谱法测定光果甘草中光甘草定的含量［J］.天津中医药，2008，25（2）：157-158.

［11］李薇，宋新波，孙成荣，等.三个不同品种甘草多糖的含量测定［J］.天津中医药，2013，30（1）：47-49.

［12］洪宇.HPLC测定三拗汤不同煎液中甘草酸的含量及其体外抑菌效果分析［J］.中药材，2014，37（6）：1071-1073.

［13］刘卉，单进军，康安，等.甘草酸和甘草次酸对芍药苷在大鼠体内药动学参数的影响［J］.中草药，2013，44（12）：1610-1614.

［14］Haghshenas V，Fakhari S，Mirzaie S，et al.Glycyrrhetinic Acid inhibits cell growth and induces apoptosis in ovarian cancer a2780 cells［J］.Adv Pharm Bull，2014，4（1）：437-441.

［15］靳凤丹.LC/MS/MS技术在药代动力学研究中的应用［J］.高师理科学刊，2009，29（3）：57-59，68.

［16］安晓霞，姜力群，张贺阳，等.LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中甘草酸和甘草次酸［J］.药学与临床研究，2013，21（2）：146-149.

［17］张军，陈玟，居文政，等.LC-MS/MS法测定人血浆中甘草次酸及其临床药代动力学研究［J］.中国药理学通报，2011，27（9）：1313-1316.

［18］张明发，沈雅琴.甘草酸及其苷元甘草次酸的糖皮质激素样作用［J］.现代药物与临床，2011，26（1）：33-35.

［19］Hou YY，Yang Y，Yao Y，et al.Neuroprotection of glycyrrhizin against ischemic vascular dementia in vivo and glutamate-induced damage in vitro［J］.Chin Herb Med，2010，2（2）：125-131.

［20］金敏，吴红金.甘草次酸药理作用的研究进展［J］.医学综述，2009，15（11）：1712-1715.

［21］金京丽，尹明浩.浅述甘草古今运用［J］.吉林中医药，2008，26（4）：52-53.

［22］王龙，王化良.炙甘草抗心律失常临床应用研究［J］.吉林中医药，2014，32（10）：1074-1076.

Method of LC-MS for the determination of glycyrrhetinic acid in rat plasma and pharmacokinetic study of glycy rrhetinic acid

WANG Xing-rui1，OUYANG Hui-zi2，DOU Ting1，BO Fang1，TU Ya-ru1，HE Jun1
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To develop a LC-MS method for the pharmacokinetic study of glycyrrhetinic acid after administration of Sanao decoction.［Methods］The method of determination was performed on Agilent Zorbax SBC18（4.6 mm×150 mm，5 μm）column using acetonitrile and water containing of 10 mM Ammonium formate as mobile phase in isocratic elution with 90∶10.The flow rate was 0.3 mL/min and the temperature was 25℃. Electrospray ionization（ESI）source was applied and operated in the negative ion mode with SIM scanning mode.The quantitative ions of glycyrrhetinic acid and ursolic acid were m/z 469.4 and m/z 455.4.Rats were oral administration with single dose Sanao decoction concentrated solution.The plasma samples were through liquid-liquid extraction pretreatment.Using the method of LC-MS for the determination of plasma concentration of glycyrrhetinic acid and calculate the pharmacokinetic parameters by DAS（ver.1.0）.［Results］The linear rang of glycyrrhetinic acid was 5～10 000 ng/mL and it's limit of quantity was 5 ng/mL.Endogenous substances did not interfere with the determination of glycyrrhetinic acid and internal standard.The methods of precision，accuracy，recovery and stability are in line with the requirements of determination of biological samples and may be applied for glycyrrhetinic acid pharmacokinetic study.［Conclusion］The method has the characteristics of high specificity，high accuracy，good sensitivity，and can be used for glycyrrhetinic acid pharmacokinetic study.

Sanao decoction；glycyrrhetinic acid；pharmacokinetic

R285.5

A

1673－9043（2015）04－0229-04

国家自然科学基金项目（81303140）；高等学校博士学科点专项科研基金（20131210120015）。

王兴蕊（1989－），女，硕士研究生，研究方向为药物分析。

何俊，E-mail：hejun673@163.com。

（2015-04-15）