前列腺小体外泌蛋白ELISA检测方法的建立和初步评价＊

曾燕，张娇，陈艳华，孟洁，刘振兴，宋华，徐军，胡成进，陆群

前列腺小体外泌蛋白ELISA检测方法的建立和初步评价＊

曾燕，张娇，陈艳华，孟洁，刘振兴，宋华，徐军，胡成进＊，陆群

目的建立前列腺小体外泌蛋白ELISA检测方法并评价其作为慢性前列腺炎辅助诊断的可行性。方法从慢性前列腺炎患者尿液中提取并纯化前列腺小体外泌蛋白，以纯化的前列腺小体外泌蛋白为抗原免疫实验BALB/c小鼠，得到单克隆抗体经过纯化后，建立ELISA检测方法。并对笔者所在医院的140例慢性前列腺炎患者尿液及正常人60例尿液中的前列腺小体外泌蛋白含量进行检测和评价。通过正交试验确定特异性抗体和酶标抗体的最佳工作浓度，并对试剂盒进行了4℃，12个月保存实验。确定该检测方法的临界值。结果慢性前列腺炎症患者尿液中前列腺小体外泌蛋白含量明显高于正常人尿液中含量，有显著性差异（Z=10.74，P＜0.05）。实验室临界值为1.24 ng/ml。在140份慢性前列腺炎患者尿样中，阳性率为88.5%；特异性为90%。将前列腺小体外泌蛋白试剂盒测定结果与临床金标准比较［Kappa=0.75（95%CI=0.652 to 0.848），P＜0.01］，该检测试剂盒与临床金标准有高度一致性。试剂盒各个成分在低温保存12个月可以保持稳定。结论前列腺小体外泌蛋白的检测试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性合格，可以为临床前列腺炎诊断提供可靠的依据。

前列腺小体外泌蛋白；ELISA检测方法；评价

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）是泌尿外科中青年男性患者最常见的疾病之一，据报道其占门诊量的30%。据流行病学调查，我国成人男性人群中，10%以上有前列腺炎样症状，50%男性不同时期均患过前列腺炎［1］。在前列腺癌中，炎症的存在及细胞上皮组织损伤后再生被认为是恶性转化的关键因素。文献指出，大约12%前列腺炎如不及时治疗可转化为前列腺癌。所以前列腺炎严重影响男性健康［2-4］。前列腺炎临床表现因患者个体差异而缺乏特异性，因此在临床上治疗效果一直不满意。根据1997年美国国立卫生研究院（NIH）对前列腺炎的分类，临床上通常以Ⅲ型慢性前列腺炎多见，约占90%左右。在临床实际工作中，泌尿男科医师对首诊的CP患者选择的检查方法前3位的是尿液分析、前列腺液检查、直肠指检。前列腺液检查和直肠指检对患者有一定侵入性，因此非常需要简便无侵入性，同时准确可靠的分子诊断方法［5］。

前列腺小体（prostasomes）是由人类前列腺上皮细胞分泌的一种亚细胞结构，平均直径150 nm，存在于前列腺导管上皮细胞顶部富含高尔基体的地方，由前列腺导管上皮通过胞吐作用和胞透作用分泌至管腔［6，7］。Alba Minelli等在前列腺疾病患者血清中检测到前列腺小体［8］。本文提供一种基于前列腺小体外泌蛋白定量的间接酶联免疫吸附方法，作为前列腺炎辅助诊断，现报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料按照《中国泌尿外科疾病诊断治疗指南》中前列腺炎的诊断标准［2］，2012年—2013年从济南军区总医院收集慢性前列腺炎140例。年龄16～72岁，平均34岁。正常人体检尿液60份，年龄20～68岁，平均34岁。尿常规均正常。尿液收取后立即检测，或放-20℃冰箱保存。2个月之内检测完毕。

1.2试剂和仪器前列腺小体外泌蛋白和特异性鼠抗人前列腺小体外泌蛋白检测抗体由美国EliOnco公司提供。96孔聚苯乙烯检查板由美国Becton-Dickson及美国Thomas Fisher Scientific提供。HRP标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司。自配清洗液、显色剂、终止液。清洗液为含0.5%吐温-20 的PBS溶液；显色剂A含柠檬酸、乙酸钠、过氧化脲；显色剂B含柠檬酸、EDTA、TMB盐酸盐、硫代硫酸钠溶液；终止液为2 mol/L H2SO4。

DEM-Ⅲ自动酶标洗板机，采用北京拓普分析仪器有限公司。酶标仪（680型）购自BIO-RAD公司。WHS型智能恒湿恒温箱，购自宁波江南仪器厂。微量移液器，采用Eppendorf，Gilson品牌。

1.3ELISA检测方法建立将稀释为一定比例的前列腺小体外泌蛋白标准品包被在96孔板中（B1-F1孔），其余孔加尿液标本，37℃恒温箱孵育1 h，洗板机洗板5次后，加1%BSA封闭，每孔100微升，37℃恒温箱孵育40 min，洗板5次。加入特异性前列腺小体外泌蛋白检测抗体，37℃恒温箱孵育40 min，洗板后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃恒温箱孵育20 min，洗板后避光显色20 min，加入终止液，终止反应。用酶标仪测定各反应孔在双波450，630 nm处的OD值。根据不同浓度的标准品OD值绘出标准曲线，将患者的数值与阳性标准孔数值比较，从而得出被测试者尿样本的实际前列腺小体外泌蛋白浓度。

样本检测：用间接ELISA方法检测140例前列腺炎症和60例正常人尿样本。根据临床样本检测真阳性a，假阳性b，假阴性c，真阴性d，求出检测灵敏度，特异度，阳性预期值，阴性预期值并计算Cutoff值。

1.4方法学鉴定

1.4.1分析精密度批内变异：用两个浓度水平的样本（炎症和正常人）各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV。批间差：用3个批号的试剂盒分别检测同样两份标本，各重复10次，计算30次结果的平均值M和标准差SD，求出变异系数CV。

1.4.2各组成部分的稳定性实验将检测酶联板，特异性抗体，酶标抗体，显色剂，阳性标准品等各组成部分放入4℃冰箱，检测1次/m，观察有效期限。1.4.3正交实验把特异性结合抗体按照1∶50；1∶100稀释；酶标抗体按照1∶2000；1∶2500；1∶3000；1∶5000稀释，然后先加样本37℃孵育1 h，洗板封闭后，加不同浓度的特异性抗体后，37℃孵育40 min，洗板5次后加入不同浓度的酶标抗体，37℃孵育20 min后，洗板显色。根据OD值数据选出最佳的特异抗体和酶标抗体的使用浓度。

1.4.4检测方法比较（ELISA双抗夹心法和间接法）检测方法的确定对于检测效果具有至关重要的作用，在确定了抗体和试剂及测试时间以后必须对检测方法进行筛选，然后比较了双抗夹心法和间接法对检测结果的影响。

1.5统计学处理采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理。前列腺炎症患者与正常人的样本差异比较采用秩和检验和配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1临床样本检测结果前列腺炎症患者尿样和正常人尿样本PESP检测，炎症患者尿液中前列腺小体外泌蛋白含量与正常人相比较明显升高，有显著性差异［（3.013±2.199）ng/ml vs（0.734±0.574）ng/ ml，Z=10.74，P＜0.05］。

2.2方法学鉴定结果

2.2.1灵敏度、特异度、符合率评价按方案要求对200例样本进行临床金标准和考核试剂的两种检测。计算前列腺小体外泄蛋白检测试剂盒临床检测的灵敏度、特异性、总符合率、阳性预期值、阴性预期值等统计学结果。根据临床金标准选择慢性前列腺炎140例，正常对照40名，用本试剂盒在140例炎症患者中检出阳性124例，阴性16例。在正常对照60名中，阳性16名，阴性44名。

灵敏度=a/（a+c）×100%=124/140×100%=88.5%；特异度=d/（b+d）×100%=54/60×100%=90%；总符合率=（a+d）/（a+b+c+d）=（124+54）/200×100%=89%。2.2.2一致性分析采用SPSS 16.0统计软件对前列腺小体外泌蛋白检测试剂盒和临床诊断金标准进行一致性检验，结果显示Kappa=0.75（95%CI= 0.652 to 0.848），P＜0.01，一致性具有非常显著性统计学意义。

2.2.3准确性检验（ROC曲线分析）评价采用SPSS 16.0统计软件对前列腺小体外泌蛋白试剂盒检测结果进行ROC曲线拟合，结果见图1。

图1　前列腺小体外泌蛋白的ROC曲线

如图1所示，ROC曲线下面积为0.963（SE= 0.0125，95%CI 0.927～0.985，Z=36.948，P＜0.01），表示前列腺小体外泌蛋白试剂盒对慢性前列腺炎具有较好的诊断价值。选择Youden指数最大的点对应的界值作为慢性前列腺炎的诊断标准，得出前列腺小体外泌蛋白的诊断点为1.24 ng。

2.2.4精密度分析用两个浓度水平的样本（阳性和阴性）各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，得出变异系数CV＜8%。用3个批号的试剂盒分别检测同样两份标本，（阳性和阴性）各重复10次，计算30次结果的平均值M和标准差SD，其变异系数CV为10.1%。结果见表1。从以下数据可以看出该试剂盒反应体系具有良好的精密度。

表1　反应体系的精密度检测

表2　试剂盒4℃保存实验

2.2.5试剂盒保存的稳定性实验评价试剂盒置4℃条件下干燥保存，每月定期抽检直至12个月，检测前列腺炎阳性样本和正常人样本。结果见表2。从表2可见1～12月，阳性样本ng值每月无明显降低，阴性样本数值稳定，均在1 ng以下。P/N＞4.7。各个月的标准品曲线R2值都在0.99以上，非常接近1。在保存12个月后，阳性样本ng值依然达到正常情况的90%。说明试剂盒各个成分在低温保存12个月可以保持稳定。

3　讨论

慢性前列腺炎中组织受到炎性细胞的浸润，从而释放出各种活性物质和趋化因子，一种称为前列腺小体的外泌蛋白通过解剖通道分泌进入男性生殖道。研究提示，前列腺疾病中可能存在表达前列腺小体蛋白质组的独特表型，已知的分子功能是多种多样的，包括结构膜蛋白、酶、监管蛋白和信号转导分子等［9］。慢性前列腺炎病程中，多种致病因子启动Wnt途径，Wnt信号通路异常表达，相应下游活性物质增加，与前列腺小体的释放和表型的变化均有密切的关系［6］。高浓度的前列腺小体可以在精液、前列腺液中发现，电镜下有两种形态：小、黑色的，外面紧包电子致密物；大的，浅色的，不致密的结构，直径40～500 nm。有脂质双层膜，多层融合排列，富含胆固醇。相似的结构也可以在前列腺细胞系的培养液中发现。前列腺小体的主要成分是鞘磷脂，含有磷酸胆碱和神经酰胺。胆固醇和磷脂的比例是2∶1，而典型的哺乳动物细胞膜上的此种比例是1∶1［10-13］。前列腺小体蛋白有多重生理功能。抑制PMN中NADPH氧化酶的活性，从而起到抗菌抗氧化作用［14，15］。在体外培养实验条件下，小剂量的前列腺小体呈现出对肺炎球菌、地衣形杆菌、侧孢杆菌、Megatenium杆菌的强烈抑制作用，这种抗菌活性与细胞膜的变性密切相关。在扫描电镜下，可直接观察到前列腺小体黏附到光滑的细菌包膜表面，是其外观逐渐变粗破裂，引起细菌死亡。

在精液中前列腺小体比中性粒细胞发挥更强的抗菌功能。前列腺小体可作为强有力的抗氧化剂，中和白细胞的ROS作用。前列腺小体的特殊的脂质结构和成分是其抗氧化抗菌功能的关键因素，推测在炎症的过程中可以检测到前列腺小体，同时此研究为开发新类型的抗菌药物提供了理论基础［16］。根据在炎症状态下前列腺小体外泄蛋白质组的独特表型，设计特异性抗体，仅仅通过尿液检测，就能达到对慢性前列腺炎的早期明确诊断的目的。

从本检测的200例尿样中，可以看出前列腺炎患者和对照组正常人尿液中前列腺小体外泌蛋白含量的分布存在显著性差异，患者样本检测到的前列腺小体外泌蛋白的浓度明显高于对照组中前列腺小体外泌蛋白的浓度。其灵敏度为88.5%；特异度为90%，总符合率达到89%。并且临床诊断金标准与本检测结果相比有很好的一致性。

前列腺小体外泌蛋白外泌蛋白的检测可以为临床前列腺炎诊断提供一个可靠的检测方法。同时该试剂盒经过严格的4℃条件下长时间保存实验，检测结果稳定，符合国家食品药品监督管理总局体外诊断试剂考核标准。此检测方法简便可靠，适用于临床慢性前列腺炎的辅助诊断。

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［本文编辑：吴蓉］

Establishment of ELISA detection method for prostatic exosomal protein，and its primary evaluation

ZENG Yan①，ZHANG Jiao，CHEN Yan-hua，et al.①Onco Biomedical Technology Suzhou CO.，Ltd.，Taicang，Jiangsu 215414，China

ObjectiveTo shape ELISA detection method for prostatic exosomal protein［PESP］and to evaluate the method of applying indirect ELISA for the assistant diagnosis of chronic prostatitis in its feasibility. MethodsPEP was isolated from the urines of chronic prostatitis patients and used as the immunogen for generating mouse monoclonal antibodies；the purified antibodies were used to establish an indirect ELISA detection method to study 140 urine samples of chronic prostatitis patients and 60 normal control＇s urine samples collected from the department of urology in Jinan Military Greneral Hospital.The optimal dilution of specific antibody and secondary antibody were surveyed through the orthogonal trial.The kits stored at 4℃for 12 months were tested. Differences between two groups and critical value were evaluated by using SPSS 16.0 software.ResultsThe content of PESP in chronic prostatitis sample was much higher than the normal control samples，that had significant differences between the two groups（Z=10.74，P＜0.05）.The critical value in the laboratory is 1.24ng/ml. There were perfectly consistent compared with the results of PESP testing kits and clinical gold standard（Kappa= 0.75［95%CI=0.652 to 0.848］，P＜0.01）.The components of the prostasomes kits can be stabilized storing at 4℃for 12 months.ConclusionThe prostasomesELISA kits is specific，sensitive，stable，and may provide a simple rapidly and reliable method for clinic prostatitis diagnosis.

Prostasomes（prostatic exosomal protein，PESP）；Prostatic disease；Indirect ELISA

R697.33

A

［自然基金项目］NIH-CA111891［美］

215414江苏太仓昂科生物医学技术有限公司（曾燕，张娇，孟洁，刘振兴）；美国北卡罗来纳州Brody医学院解剖细胞系（陈艳华，陆群）；250031山东济南，济南军区总医院泌尿外科（宋华），实验诊断科（徐军，胡成进）

胡成进，Email：hcj6289@163.com