现代分子生物学技术在食品、药品微生物检测中的应用

刘欣 姜庆 戚威

(1.潍坊市食品药品检验检测中心 山东潍坊 161061;2.临沂市食品药品检验检测中心 山东临沂 276000;3.潍坊市食品药品检验检测中心 山东潍坊 161061)

近年来,随着人们物质文化生活水平的不断进步,人们对于食品、药品的质量和安全性问题也越来越重视。根据相关调查显示,食源性疾病和药源性疾病患者的比例正在逐年上升,严重影响了人类的身体健康及生命安全[1]。随着现代分子生物学的逐渐发展,其为食品和药品微生物检测工作提供了新的发展思路。笔者现就现代分子生物学技术在食品、药品微生物检测中的应用及进展进行相应的探讨,旨在为微生物检测及分型方法的发展提供依据。

1 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应(PCR)是指在体外对特定的DNA片段进行迅速扩增的一种技术,其机理为在机体外对目标DNA和引物进行变性、退火、延伸等3个步骤,以使目标DNA进行迅速的特异性扩增。目前,人们通常采用PCR技术联合核酸测序技术对微生物的基因型进行确定。随着PCR技术的逐渐发展,其目前已发展多种相关的技术,且在微生物检测中得到了广泛的应用,具体包括:(1)多重PCR技术:该技术又称为多重引物PCR技术,与常规PCR技术相比,其在PCR技术的翻译体系中加入了多对特异性的引物。该技术除了能够同时对多种致病菌进行检测外,还可以准确的分类致病菌的亚型,并且还能够够对微生物的致病性进行有效的判断。(2)免疫捕获PCR(IMPCR):该技术是通过将PCR技术与抗原抗体反应结合在一起,用于对微量抗原进行检测的新技术。IM-PCR既保留了PCR技术的高度灵敏性,又使用了抗原抗体反应的特异性,具有操作简单、检测迅速、成本低及高度特异性等特点,研究表明其检测的灵敏度可以达到普通PCR技术的100倍,但是该方法尚未成熟,使用还受到了一定的限制[2]。(3)荧光定量PCR:由于受到模板、引物及酶等因素的限制,常规PCR技术无法根据其扩增终产物对起始模板的拷贝数进行计算,即不能定量分析初始模板。而荧光定量PCR(RT-PCR)是通过在普通PCR技术的基础上加入荧光基团,通过积累荧光信号来实时监测PCR的整个过程,进而对初始模板进行定量分析。

2 变性梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术的机理为按照DNA在不同浓度变性剂中接连程度的不同而体现出各不相同的电泳迁移率,从而对大小相同但碱基组成不同的片段进行分离。该技术联合DNA测序技术常用于进行相似性聚类分析,在对食品和药品的菌落组成、菌落动态变化及对食源性致病菌的检查中得到了较为广泛的应用。相关学者通过对DGGE、PCR及核算测序技术系统进行构建和优化,有效分析了中药川芎中真菌的群落结构,并通过联合DNA测序技术,对不同产区中中药川芎中真菌的差异性进行了想要的探究,从而得出了中药川芎中真菌种群的种群结构和多样性具有的固定性等是影响中药川芎地道性产生的关键因素[3]。DGGE在对微生物种群的多样性及动态等方面具有一定的优势,但是其不能检测微生物的数量和代谢活性。

3 基因芯片技术

基因芯片技术的机理是通过和固定标记的、已知序列的核酸探针杂交后在进行核苷酸测序的方法,该技术目前在临床诊断、新基因寻找、药物的筛选及微生物检测等领域得到了广泛的应用,其具有高度的多样性、自动化、并行性及微型化,能够在同一芯片上同时对多种维生素进行迅速检测。相关学者在传统发酵食品的发酵过程中分别采用宏观基因组学、荧光定量PCR及基因芯片等3中技术对微生物的多样性及功能进行检测,结果显示基因芯片具有搞高通量和集约化的优点,并且通常联合宏转录组技术可以有效分析微生物的群落和功能[4]。

4 随机引物扩增多态性技术

随机引物扩增多态性(RAPD)技术的机理为使用8～12个核苷酸长度的随机引物于低温环境下退火,经过基因组DNA和引物之间的非特异位点错配进行复性,同时利用PCR技术进行扩增。目前,RAPD技术在真菌、支原体和细菌等微生物的分型中得到了非常广泛的应用。相关学者通过利用PAPD技术对淡水中分离出来的溶血弧菌和溶藻弧菌进行了有效的分型[5]。PAPD联合其他技术能够加快对重要基因的获取速度,结合染色体步移技术可以对迅速完成对相关基因克隆分离及定位,而随着该技术的成熟,其能够在微生物的鉴定和分型上发挥更重要的作用。

5 结语

食品与药品中存在的病原微生物直接关系到食品、药品的质量和安全,因此寻求新的、准确的、灵敏度高的微生物快速检测技术对于确保食品和药品的质量安全具有非常重要的意义。现代分子生物学技术的逐渐发展为食品、药品微生物检测工作提供了新的发展思路,明显提高了微生物鉴定及分型的效率、准确性及灵敏度,并且还能够对微生物进行有效的定性和定量。但是传统方法依然在微生物的检测和鉴定中依然具有无法替代的作用[6]。由此可见,在食品、药品微生物检测工作中联合传统方法和现代分子生物学技术能够得到更为准确和客观的检测结果,以有效支持相关部门对食品和药品的质量控制,确保人们的身体健康。

[1]刘锐萍,王峰,刘珊珊等.食品、药品微生物检测实验室质量控制方法分析[J].中国微生态学杂志,2013,25(7):847-850.

[2]胡路.食品卫生微生物检测用培养基质量控制探讨[J].中国科技纵横,2014,15(14):258-258,260.

[3]张静华.药物微生物检测实验室质量控制方法研究[J].医药前沿,2014,42(14):148-149.

[4]欧阳丽影,杨铮,杨利红等.黑龙江省保健食品微生物检测结果分析[J].中国保健营养(下旬刊),2014,37(5):2968-2969.

[5]纪亮.“2012中国食品微生物检测技术及实验室管理交流会”在苏州举办[J].中国计量,2012,19(6):37-37.

[6]张咏梅.微生物检测技术的发展现状[J].山东商业职业技术学院学报,2013,13(6):封2-封3.