微小RNAs在破骨细胞分化调控中的研究进展

连俊翔 杜玮 孟姝

口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院牙周病科（四川大学），成都 610041

牙槽骨是骨骼系统中代谢改建最活跃的部分，正常情况下其吸收与新生维持在平衡状态。牙周炎可破坏牙槽骨的代谢稳态，引起牙齿松动和脱落。破骨细胞是体内唯一具有骨吸收功能的细胞，在牙槽骨吸收过程中具有重要作用，其形成、增殖、分化及功能受多种细胞及其产物的调节[1]。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一组由22～25个核苷酸构成的非编码单链RNA，参与转录后基因表达的调控，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、组织炎症及肿瘤发生等过程。随着miRNAs的发现，关于miRNAs参与基因转录后调控的功能愈来愈受到重视。目前已证实，miRNAs可通过调控转录因子的表达，直接或间接地影响破骨细胞的分化及功能[2]。

1 破骨细胞的主要调控途径

在牙周炎症组织中，成骨细胞和活化T淋巴细胞分泌的巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）和核因子-κB受体活化因子配基（receptor activator for nuclear factor kappa B ligand，RANKL）是直接参与破骨细胞分化的两种细胞因子。M-CSF能诱导单核/巨噬细胞表达核因子-κB受体活化因子（receptor activator for nuclear factor kappa B，RANK），使其分化成为破骨细胞前体。某些促进骨吸收的细胞因子，如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、白细胞介素（interleukin，IL）-1和IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，均可刺激RANKL大量表达，促进其与破骨细胞前体表面的RANK结合，诱导多核破骨细胞的分化成熟。某些骨保护因子，如降钙素、转化生长因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-17等，介导产生的骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）可竞争性地结合RANKL，抑制破骨细胞分化成熟和骨吸收。RANK/RANKL/OPG信号通路是调节破骨细胞的经典途径，已有大量研究关注破骨细胞分化过程中重要的转录因子，如c-Fos、活化T细胞核因子1蛋白（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）等[1]。此外，参与调控破骨细胞分化的信号途径还有钙离子通路，NF-κB通路，有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路，细胞外信号调节激酶（extracelluar signal regulated kinase，ERK）途径，JNK（Jun N-terminal kinase）途径及钙调磷酸酶/活化T细胞核因子通路等[3]。

2 促进破骨细胞分化及功能活动的miRNAs

由于破骨细胞分化和功能受多条信号通路调控，miRNAs可能通过抑制某些关键基因的表达调控破骨细胞分化和功能，在骨代谢疾病中发挥作用。miRNA-155、miRNA-146a、miRNA-181a和miRNA-223在骨关节炎患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）的表达水平明显高于健康人。在牙周炎小鼠的上颌骨中，miRNA-146a表达也显著升高，同时TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的表达水平也明显升高[4]。炎症因子引发的持续性炎症会介导宿主免疫反应，加重牙槽骨丧失[5]。以上miRNAs的高表达可能与骨破坏有关[6]。此外，在牙周炎患者的牙龈组织中，发现miRNA-146、miRNA-451、miRNA-223、miRNA-486-5p、miRNA-3917有明显的高表达[7-8]，提示这些miRNAs可能与牙周炎的炎症发生及牙槽骨破坏有关。

在Dicer基因敲除的骨髓源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）中，miRNA-155的表达被抑制，src同源2肌醇5'磷酸酶（src homology 2 domain-containing inositol-5-phosphatase，SHIP）的表达水平升高，破骨细胞形成显著减少[9]。miRNA-155的靶基因SHIP能抑制破骨细胞分化，还可抑制多条炎症通路。在类风湿性关节炎患者的关节滑膜和滑膜液中检测到miRNA-155高表达，miRNA-155通过抑制SHIP-1的表达而促进炎症反应，同时促进破骨细胞分化[10]。在miRNA-155基因敲除的关节炎大鼠体内，破骨细胞明显减少，骨吸收活动减弱，而miRNA-155基因敲除的BMMs的破骨细胞向分化也被抑制，但破骨细胞前体数量与对照组并无明显变化，提示miRNA-155可能促进破骨细胞前体分化为成熟破骨细胞[11]。然而，关于miRNA-155在破骨细胞分化中的作用仍存在争议。研究[11-12]发现，破骨细胞分化中加入干扰素-β可诱导miRNA-155的表达，miRNA-155能抑制破骨细胞分化的关键因子细胞因子信号传递抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling1，SOCS1）和色素形成相关蛋白小眼球相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF），从而抑制破骨细胞分化。同时，miRNA-155还参与调控成骨细胞的分化过程。miRNA-155基因敲除的MC3T3-E1细胞中靶基因SOCS1表达增强，抑制TNF-α激活的JNK信号通路，使成骨明显减少。Xie等[13]发现，hsa-miRNA-155在牙周炎患者牙龈中的表达明显低于牙周健康组，与类风湿性关节炎的情况不一致，可能是由于牙龈细胞成分的多样化增加了miRNAs调控的复杂性。尽管牙周炎与类风湿性关节炎均表现为以炎症反应为主伴随破骨活动增强的疾病，但miRNA-155在牙周炎的炎症反应及骨破坏过程中的调控机制仍有待进一步研究。

miRNA-21在BMMs破骨细胞向分化中高表达，抑制其靶基因程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）的表达，解除PDCD4对c-fos的抑制，促进破骨细胞分化。c-fos是破骨细胞分化的关键转录因子，也是破骨细胞特异的下游靶基因，c-fos基因敲除的转基因小鼠出现骨硬化症[14-16]。miRNA-21的表达水平与c-fos呈正相关关系，miRNA-21表达水平在c-fos缺乏的BMMs中随之下降，提示miRNA-21/PDCD4/c-fos所形成的正反馈效应环在促进破骨细胞产生及分化中发挥调控作用[17]。

在BMMs细胞中，miRNA-223的表达可被PU.1激活，抑制靶基因核因子I-A，从而增强M-CSF受体（M-CSF receptor，M-CSFR）的表达，同时施加正反馈作用于转录因子如PU.1和c-fos，形成M-CSF/PU.1/miRNA-223/M-CSFR正反馈效应环促进破骨细胞分化[18]。但Sugatani等[19]发现，RAW264.7细胞中pre-miRNA-223高表达可完全阻断破骨细胞形成，并且miRNA-223在破骨细胞中的表达水平较在BMMs中低。Shibuya等[20]发现，类风湿关节炎患者中miRNA-223表达升高，尤其是在急性重度滑膜炎和伴有骨破坏的患者；但在体外共培养体系中，miRNA-223过表达却使破骨细胞数量呈现miRNA-223剂量依赖性减少，miRNA-146也具有与miRNA-223类似的现象，二者均在类风湿关节炎的滑膜中高表达，并且其过表达能降低炎症因子和破骨细胞的生成，成为炎症和破骨细胞生成的负向调控因子；这提示在类风湿关节炎中，miRNA-223和miRNA-146在调控破骨细胞发生时需要适宜的表达量[20-22]。

Cheng等[23]发现，RANKL和M-CSF刺激的CD14和PBMCs中miRNA-148表达升高，抑制V-maf肌纤维肉瘤同源癌基因B的表达，减弱其抑制破骨细胞分化的作用。在卵巢切除小鼠体内也发现，抑制miRNA-148a表达可显著增加小鼠骨密度。此外，miRNA-9718可抑制活化的STAT3蛋白抑制剂（protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3）的表达，促进破骨细胞生成，在miRNA-9718基因沉默的卵巢切除小鼠体内骨吸收活动被抑制，骨量增加[24]。

miRNAs差异表达分析发现，miRNA-31在破骨细胞中的表达水平较BMMs升高了18倍，miRNA-31的靶基因RhoA是肌动蛋白和细胞骨架微管转导细胞外信号的重要分子开关，miRNA-31抑制能引起RhoA蛋白水平升高，导致破骨细胞外周肌动蛋白环形成受损，抑制破骨细胞形成和骨吸收活动[25]。

有学者[26-27]将白人女性骨质疏松患者分为高骨密度组与低骨密度组，对比两组患者PBMCs的miRNAs表达差异，先后发现miRNA-133a和miRNA-422a在低骨密度组中升高；miRNA-133a和miRNA-422a与其靶基因具有负相关关系，但不具有统计学意义。miRNA-133a还参与调控成骨细胞的分化[26,28-29]，在抗骨质疏松药物伊班膦酸盐作用下，人牙周膜干细胞中的miRNA-133a表达升高[26,30]，而牙周膜干细胞是成骨细胞前体的重要来源[31]，miRNA-133a的高表达可能与抑制人牙周膜干细胞成骨向分化有关。

3 抑制破骨细胞分化及功能活动的miRNAs

Guo等[32]通过研究证实，在PBMCs破骨细胞向分化过程中miRNA-125a表达降低，而miRNA-125a过表达能抑制破骨细胞分化和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）及NFATc1的表达。肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）是miRNA-125a的靶基因，是维持破骨细胞的细胞骨架和骨吸收活动的关键因子。NFATc1与miRNA-125a的启动子结合抑制其表达，形成miRNA-125a/TRAF6/NFATc1负反馈调节环。NFATc1是破骨细胞分化中关键的转录因子，可通过与破骨细胞特异基因启动子结合，如TRAP、组织蛋白酶K、降钙素受体、整合素β3等发挥转录调控作用[32]。NFATc1基因敲除的小鼠可出现严重的骨硬化症，破骨细胞数量显著减少，骨吸收功能明显降低[33-34]。Nakasa等[35]发现，miRNA-146a能通过抑制TRAF6而下调c-Jun、NFATc1、PU.1及TRAP的表达，从而抑制PBMCs向破骨细胞分化；而对关节炎小鼠静脉注射miRNA-146a能抑制关节骨破坏。miRNA-146a/b可结合至TRAF6和IL-1受体相关激酶1（IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）mRNA的3'端非翻译区，抑制其蛋白表达，从而调控IRAK1和TRAF6参与的免疫反应和破骨细胞分化过程[36]。

在绝经期骨质疏松症患者的PBMCs中miRNA-503表达显著降低，而miRNA-503过表达可抑制PBMCs破骨细胞向分化，RANK是其靶基因。在卵巢切除小鼠中沉默miRNA-503可上调RANK蛋白表达，促进骨吸收，而过表达miRNA-503则能抑制卵巢切除小鼠的骨吸收，提示miRNA-503在绝经期骨质疏松症的发展中具有重要作用[37]。

Rossi等[38]发现，miRNA-29b在人破骨细胞分化过程中表达下降，在破骨细胞中转染miRNA-29b使TRAP、基质金属蛋白酶-9、cathepsin K及NFATc1蛋白水平下调，并破坏肌动蛋白环的形成。miRNA-29b通过抑制其靶基因c-fos和基质金属蛋白酶-2的表达调控破骨细胞分化和骨吸收活动。而Franceschetti等[2]的研究结果与之相反，他们发现miRNA-29a/b/c在破骨细胞分化过程中表达升高，而miRNA-29基因敲除则破坏破骨细胞分化及其前体迁移。两者研究结果的差异可能是由于选用了不同的细胞所致，前者选用的是人成熟破骨细胞，而后者使用的小鼠骨髓细胞和RAW264.7细胞系是具有分化潜能的前体细胞。miRNA-29对破骨细胞分化的调控作用尚需进一步研究证实。

miRNA-124在RANKL诱导的BMMs破骨细胞分化中表达降低，pre-miRNA-124转染BMMs后，NFATc1表达显著下调，抑制破骨细胞向形成，破骨细胞前体迁移活动显著减少，但不影响NFATc1的上游转录因子的表达水平，如NF-κB p65和c-Fos。进一步研究[39]发现，NFATc1过表达可逆转miRNA-124的抑制作用，同时抑制miRNA-124可以显著促进依赖NFATc1的TRAP和Cathepsin K的基因表达，提示miRNA-124通过抑制靶基因NFATc1的表达来调控破骨细胞的分化。

miRNA-26a在破骨细胞发生的晚期上调，直接影响结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）/CCN家族2（CCN family 2，CCN2）的表达水平，而CTGF/CCN2能上调树突状细胞特异性跨膜蛋白（dendritic cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP）而促进破骨细胞分化。在破骨细胞前体中表达miRNA-26a能够抑制破骨细胞分化，肌动蛋白环形成和骨吸收。miRNA-26a抑制剂能上调CTGF的表达，促进破骨细胞的生成并增强其功能[40]。

4 发展与展望

牙周炎是成年人失牙的最主要原因，现有治疗手段对牙周炎骨丧失的治疗效果并不理想。牙周基础治疗仅能控制或减缓骨吸收，引导组织再生术和引导骨组织再生术等手术治疗也存在适应证选择的局限。有研究采用炎症细胞因子拮抗剂或诱导破骨细胞凋亡的方法来抑制骨吸收，但由于该方法可能导致颌骨坏死、肾衰竭等严重不良反应而导致其临床应用受到限制。与破骨细胞相关miRNAs的发现使miRNAs成为调控破骨细胞分化与功能的新靶点，为治疗破骨细胞主导的骨代谢疾病开辟了新思路。但是，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作为非编码RNA的另一重要成员，因其多数结构与mRNA有一定相似性，所以可以作为一种竞争性内源性RNA与miRNAs相互作用，参与靶基因的表达调控[41]。综上所述，单个miRNA的调控作用相对有限，进一步研究需综合考虑多个miRNAs之间的相互作用关系，及其在基因水平的精细调控作用。将来，miRNAs的研究成果有望与传统的牙周基础治疗和再生手术治疗相结合，共同发挥优势，为临床预防和治疗牙周炎导致的牙槽骨吸收提供新的方法。

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