猪多杀性巴氏杆菌的鉴定方法和耐药性的研究进展

彭苗苗，傅胜才

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)遍布世界各地，是多种动物的重要病原菌，本菌以荚膜抗原和菌体抗原区分血清型，前者有5个型，后者至少有16个型。该菌正常存在于多种动物的口腔和咽部黏膜，对鸡、鸭、鹅、野禽、猪、牛、羊、马、兔等均可致病，当动物处于应激状态和机体抵抗力下降时，细菌大量繁殖并致病，发生内源性感染。其感染发病过程分为急性型和慢性型，急性型呈出血性败血症迅速死亡，如牛出血性败血症、猪肺疫、禽霍乱、兔巴氏杆菌病等；慢性型呈萎缩性鼻炎（猪、羊）、关节炎及局部化脓性炎症等。自然感染病愈后的家禽对其他血清型具有交叉免疫力，但用体外人工培养的细菌制成的灭活苗，则不能产生对异种血清型的免疫。

猪多杀性巴氏杆菌病致使猪群生长缓慢，严重影响饲料报酬，在我国规模化猪场常有发生，并呈地方流行性和散发性流行，给养猪业带来巨大经济损失。因分型复杂，地区差异性较大，各血清型之间交叉免疫保护作用较弱，市场上购买的疫苗往往起不到预防作用。目前，临床上猪多杀性巴氏杆菌病的控制主要依赖于抗生素的使用，但近年来由于抗生素的大量不合理使用和滥用，使得动物源Pm表现为耐药率高、耐药范围广、呈多重耐药等特点，其直接后果不仅给控制和治疗该病带来困难，而且加剧了抗生素在动物体内的残留，影响动物产品质量，为人类健康带来隐患。

1 猪源Pm的分子生物学鉴定研究现状

对于临床无菌采集到含有Pm的病料，一般要进行分离纯化、形态学鉴定、生化鉴定、动物回归试验以及分子生物学鉴定共五个步骤，国内外研究主要集中在Pm 的分子生物学的鉴定方法上。Townsend等利用基因消减的方法对Pm进行研究发现了Pm基因组上1个特有区域，针对该特异性DNA序列设计引物，所有的Pm都可以扩增出1个460bp的片段，即Pm-PCR。我国的唐先春等建立的PCR检测方法来鉴定猪源Pm，对比传统的生化鉴定，PCR具有特异性高、灵敏度高的特点，能检测含菌量为103/mL（CFU=103/mL）的菌落，利用PCR鉴定Pm近年来在国内得到了广泛的应用。在这基础上，黄海燕等根据GenBank已公布的多杀性巴氏杆菌plpE基因序列的保守片段设计合成引物，经plpE基因阳性质粒构建、反应条件的优化、特异性试验和敏感性试验，对猪源多杀性巴氏杆菌特异性PCR检测方法进行了改进优化，此方法检测Pm灵敏度能达到200cfu／mL。而后，吴斌等利用分离出的Pm菌株，根据NCBI上的序列（U52208）设计一对引物，用PCR方法扩增了猪源Pm的外膜蛋白（ompH），并克隆到载体pMD18-T（T-Vector）上，用pET28b-ompH，转化BL21并诱导表达，然后用所表达的蛋白做了ELISA检测方法的初步探讨。

环介导等温扩增技术(Loop—mediatedisothermal amplification，LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。孙建华等将自环介导等温扩增技术应用于Pm的快速检测，即以Pm的荚膜蛋白—PlpB基因为靶基因，经反应条件优化后建立了LAMP检测方法，灵敏度为25cfu/mL，为传统PCR灵敏度的10倍，且整个检测时间仅为1h左右，较传统PCR检测方法具有快速、高灵敏的优势。DongboSun等以Pm的kmtl基因为靶基因，设计 了 四 个 特 殊 引 物 PM-F3、PM-B3、PM-FIP、PM-BIP，在63℃温度下反应1h左右就能得出通过肉眼观察得到检测结果，且灵敏度达到了10cfu/mL。

虽然应用LAMP鉴定Pm具有操作简单、视觉直观检测，不需要检测仪、反应速度快、敏感性高、价格便宜等优点，但是LAMP灵敏度高很容易污染出现假阳性，这在一定程度上限制了LAMP鉴定Pm的应用。目前Pm特异性PCR仍是鉴定Pm最常用的分子生物学方法。

2 猪源Pm的耐药性研究现状

耐药性（drugresistance）又称抗药性，系指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性。当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。目前认为后一种方式是产生耐药菌的主要原因。为了保持抗生素的有效性，应重视其合理使用；Pm耐药得到了越来越多的关注，国内外积极开展了猪源Pm耐药性及耐药性机制的相关研究。

2.1 国内部分地区猪源Pm的耐药性研究现状

桂文龙等在苏中地区猪场分离得到21株Pm（2011年8月到2012年12月），并选用13种抗生素进行了药敏试验，其中头孢氨苄、复方新诺明、红霉素、链霉素、青霉素G、四环素、林可霉素、庆大霉素的耐药率都超过了50%，其中头孢氨苄、复方新诺明、红霉素、链霉素四种抗生素耐药率都超过了90%，分离株对氟苯尼考和氧氟沙星敏感的比例分别为85.71%和80.95%。韩太武等从新疆石河子地区部分规模化猪场采集并分离得到12株Pm（2014年），药敏试验显示该菌对先锋VI、氯霉素、环丙沙星敏感性较强，其耐药率分别为83.3%、75%、75%，而该菌对红霉素、庆大霉素、卡那霉素、青霉素、痢特灵、氨苄青霉素等其他几种抗生素耐药率较强，该菌对四环素的耐药率为66.7%。陈光宏等（2009）从西宁猪场分离出8株Pm，用其中4株做药敏试验，结果显示该菌对氯霉素、羧苄青霉素、链霉素、卡那霉素高度耐药，对痢特灵、丁胺卡那2种抗生素敏感。王翠霞等(2014)在甘肃某地分离出猪源4株Pm，药敏试验判定结果为4个菌株均对β-内酰胺类和大环内酯类抗生素很敏感，对磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、林可胺类和氯霉素类抗菌药物具有一定的耐药性；对四环素类和硝基呋喃类抗菌药物高度耐药。徐引弟等从河南各地猪场分离出35株Pm（2009年～2010年），选用了18种抗生素进行了药敏试验，结果显示大部分Pm对氨苄西林、万古霉素、新霉素、阿莫西林、克林霉素、链霉素、复方新诺明、庆大霉素、四环素、痢特灵等耐药，所有Pm对头孢噻呋、头孢噻肟、氟苯尼考高度敏感，绝大部分Pm对环丙沙星、头孢唑啉、头孢他啶、氯霉素、强力霉素高度敏感。廖素环等(2011)选用了41种抗生素用于源自广西的14株猪源Pm的药敏试验，实验结果显示，大多数菌株对磺胺类、硝基呋喃类和林可胺类抗菌药的耐药率比较高，均在79%以上。但对喹诺酮类和利福霉素类耐药率相对比较低，均在57%以内。菌株对氧呱嗪青霉素、头孢噻肟、卡那霉素、氧氟沙星、诺沙星、左氟沙星、恩诺沙星、多粘菌素B和利福平这9种药的耐药率在2l%～36%之间。

从以上文献中，可以看出我国Pm耐药的几个特点：（1）我国Pm耐药情况很严重，上述文献中全国各地区东、西部和北方、南方的Pm都表现出了耐药性，整体呈多重耐药，耐药率偏高的特点。（2）各地区Pm对具体的某种抗生素的耐药率差异性大，例如上述文献中苏中地区分离的Pm对头孢氨苄的耐药率为95.2%，甘肃、新疆、广西相应的耐药率分别为0%、16%、71%。（3）就上述文献而言，各地区对链霉素、卡那霉素、庆大霉素、复方新诺明、四环素、林可霉素等抗生素耐药率都比较高，而对氟苯尼考高度敏感。

2.2 国外部分地区猪源Pm及其他动物源Pm的耐药性研究现状

SwarajRajkhowa等在印度分离出44株猪源Pm，药敏试验结果表明所有菌株对氯霉素、金霉素、恩诺沙星、多西环素敏感，而大部分菌株对头孢曲松、先锋霉素、环丙沙星、庆大霉素、诺氟沙星敏感；绝大部分菌株对头孢氨苄、青霉素G、磺胺嘧啶耐药，大部分菌株对卡那霉素、四环素耐药。Mamta Tigga等人从印度恰蒂斯加尔邦分离出猪源Pm，并应用15种抗生素进行了药敏试验，结果显示，该菌株对庆大霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、甲氧苄氨嘧啶、磺胺嘧啶高度敏感，对丁胺卡那霉素、复方新诺明较敏感，而对头孢唑肟、头孢氨苄、氯唑西林、罗红霉素表现为高度耐药。MarkowskaDanie等从波兰猪场分离出45株Pm，药敏试验结果表明97%的菌株对几乎所有的抗生素敏感，包括阿莫西林、泰妙菌素、β内酰胺类如氨苄青霉素、头孢菌素、强力霉素、泰乐菌素、四环素、庆大霉素、青霉素、新霉素等。ZomuankimaVarte等从Mizoram地区分离到15株Pm，所有菌株对氨苄青霉素、氯霉素、环丙沙星、复方新诺明、恩诺沙星、红霉素、庆大霉素、氧氟沙星、利福平和四环素敏感，其余抗生素敏感度分别是土霉素（93%）紧随其后，氨苄青霉素（87%）、丁胺卡那霉素（47%）。SellyeiB等在匈牙利分离出的56株Pm（包括20株禽源Pm，36株猪源Pm）对磺胺类、四环素、第一代喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素较明显耐药，而对新的大环内酯类(泰拉菌素)，第三代氟喹诺酮类(恩诺沙星)和第四代头孢菌素(头孢喹肟)较为敏感。ShionaK.Glass-Kaastra等监测了加拿大安大略省大约1500株猪源Pm的耐药性情况（1998～2010年），结果表明，41.5%的菌株至少对一种抗生素耐药，17.1%的菌株至少对两种抗生素耐药。

从国内外的相关研究可以看出，不同国家、不同地区的猪源多杀性巴氏杆菌对各种抗生素都出现了不同程度的耐药性；加拿大、匈牙利、波兰等欧美国家Pm耐药性情况要好于我国，波兰猪源Pm对几乎所有抗生素敏感，一定程度上与发达国家更加先进的养殖技术和科学的用药标准有关；我国大部分地区的Pm呈现出耐药范围广、多重耐药、耐药率高的特点，多杀性巴氏杆菌表现出差异性的耐药性可能跟不同地区应用的抗生素种类、用量、时间长短不同、使用频率有关；某地区某种抗生素使用时间越长，则当地Pm菌株对此种抗生素耐药率越高，而一般情况下Pm对刚研发或者应用少的抗生素的耐药率较低，这与Pm耐药菌株的选择性富集扩增或耐药基因的转移有关；同时也可能与不同地区Pm的血清型分布差异有关；从上述文献可以看出我国大部分地区猪源Pm对四环素类、氨基糖苷类、青霉素类抗生素都产生较高的耐药率，而对氟苯尼考等应用时间相对较短的抗生素较为敏感。

3 小结

从上述各文献可以看出我国猪源Pm耐药性形势已不容乐观，Pm的耐药性可以看作是为适应环境而产生的自身进化的结果，其耐药性的产生是不可避免的，但是我们可以通过正确处理抗生素的使用与耐药性产生的关系来减缓这个过程；除了研究细菌的耐药机机制与新的抗菌手段以外，合理应用抗生素、尽量减少亚治疗浓度的预防性用药始终是应对猪源Pm以及其他细菌耐药的一个重要手段；不同地区的Pm耐药性差异比较明显，因此各地区分离Pm，并筛选出对当地Pm菌株有效的抗生素，有助于防治猪多杀性巴氏杆菌病在本地区甚至全国范围的流行。

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