超微量液体容积双波长参比测量方法研究

王金涛， 陈超云，2， 李志昊， 佟 林，刘子勇， 张 珑， 罗志东

（1.中国计量科学研究院，北京100029； 2.中国计量学院，浙江杭州310018；3.贵州省计量测试院，贵州贵阳550003）

超微量液体容积双波长参比测量方法研究

王金涛1， 陈超云1，2， 李志昊1， 佟 林1，刘子勇1， 张 珑1， 罗志东3

（1.中国计量科学研究院，北京100029； 2.中国计量学院，浙江杭州310018；3.贵州省计量测试院，贵州贵阳550003）

为克服静力称重法受蒸发量影响大的不足，同时适应在线测量的需要，基于Lambert-Beer定律，研究了520 nm和730 nm双波长超微液体容量光度吸收测量法，通过稀溶液浓度与吸光度之间的线性关系可以计算出待测超微量液体容积。设计了双波长参比光度吸收法的测量系统，采用与静力称重测量系统比对试验的方式对这种方法进行了验证，1μL和5μL微量液体试验数据表明：双波长参比光度吸收法和静力称重法测量结果具有良好的一致性，均符合ISO 8655的技术要求。与静力称重法方法相比，双波长参比光度吸收法对测量环境要求低，易于实现在线测量，而且可以有效减少液体蒸发对测量结果的影响。

计量学；超微量液体；容量；比对试验；双波长参比

1 引 言

为了适应DNA基因测序领域等实验的要求，自动取样的容积值范围向超微量方向发展，如1 μL量级。但是研究和使用中发现，超微量液体取样装置的失准率较高，因此必须通过周期性的性能测试和校准来监控超微量液体取样装置的准确性和可靠性［1，2］。为了适应现代大型生物医学试验和生产在线测量的需求，国际计量局技术咨询委员会CCM.FF已经将超微容量校准列入国际关键比对Key Comparison计划，以此来进一步推动该领域的国际间测量能力提升［3，4］。

目前主要使用静力称重法（Hydro-weighting方法，HW方法）进行超微量液体容积的计量校准。其基本原理为通过液体质量和密度的测量进行液态容量值的计算，具体可分为高铁氰化钾法、水称重法和水银称重法等。前两种方法准确性较差，后一种方法虽然优于前两种，但操作繁琐，对设备要求高，且水银容易挥发，对人体有害［5］。研究表明即使10μL左右的取液值在容量计量中已经属于微小容积计量测量，在静力称重测量中由于液体挥发而造成大的误差，而且工作时间长，难以保证超微量液体取样量校准的准确度。对于蒸发量的控制，主要有系数修正和饱和蒸汽抑制两种解决方法。这两种方法进行蒸发量控制的方法效果有待提高，而且静力称重法需要在精密实验室内离线测量，很难进行在线测量使用［6］。

本文根据双波长参比光度吸收（DWP）原理提出了一种非静力称重测量方法，用于超微量液体取样容积量的在线校准，并通过与静力称重法测量值进行了试验比对，验证了这种方法的有效性。

2 DWP方法基本原理

根据Lambert-Beer定律，当一束平行单色光通过单一均匀的、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度c和液层厚度b的乘积成正比

式中ε为比例常数，与入射光波长和环境温度等参数有关。选取显色剂作为待测液体，吸收波长为λS，比例常数为εS，浓度为cS，待测体积为未知量VU；稀释剂的吸收波长为λD，比例常数为εD，浓度为cD，体积为VD。将稀释比为R的显示剂溶液加入样品池中，在波长λS和λD处的吸收度为［7，8］：

式中LSV为样品测量的光程。重新放入一个新的样品池，加入体积为VD的稀释液，测量λD处的吸收度为

式中AD1为背景噪声，LS为样品测量的光程。通过待测加样设备加入体积为VU的显色液，测量λS处的吸收度为

由式（2）～式（5）得待测超微量溶液的容积VU为：

式（6）表明这种测量方法不受光程和吸收常数等因素的影响，测量结果主要取决于标准显色剂溶液稀释比R和光谱读数相对值：前者通过Class A标准玻璃容器进行稀释可以保证R具有很低的相对不确定度（10-4量级）；后者与光谱强度绝对值的测量精度相比，不确定度也大大降低。所以这种方法可以有效保证测量的不确定度，有效避免了液态介质蒸发带来的影响，而且对环境要求低。

3 试验与分析

为了验证本文提出的DWP测量方法的有效性，设计了与高精度超微量静力称重法测量系统的比对试验。为了保证静力称重法参考值的准确性，其中部分取样点在中国计量科学研究院和芬兰BIOHIT校准试验室分别进行测量。

3.1 比对试验系统介绍

3.1.1 DWP方法测量系统设计

DWP方法测量系统中采用520 nm和730 nm作为参比值测量用波长，所采用的原液和稀释液分别为Ponceau S水溶液和CuCl2·2H2O与EDTA混合水溶液［8］。

具体配置方法为：

①将0.476 g的Ponceau S加入水，配制成1 000ml溶液，作为原液；

②将1.12 g CuCl2·2H2O和3.74 g EDTA混合，加入水至1 000m l，作为稀释液；

③从原液中取5 ml加入125 ml稀释液中，混合液体为标准液。

光谱强度测量方法是保证吸光度数值准确的关键量，测量原理如图1所示。

信号光由一个标准光纤接口进入光学平台，先经一个球面镜准直，然后由一块平面光栅把该准直光色散，经由第二块球面镜聚焦，最后光谱的像就被投射到一个面阵式CCD探测器阵列上，得到不同波长的光谱响应，将这些连续波长响应值进行计算机采集和数据计算。面阵式CCD探测器阵列比线阵式CCD探测器阵列接收光信号的区域大，所以能有效提高测量系统的灵敏度。

图1 光谱强度测量原理图

3.1.2 静力称重法测量系统设计

按照ISO 8655和JJG 646—2006的要求，设计了0.1μL～10mL超微量移液静力称重法计量校准系统，最大允许误差±（0.02～60）μL，超微量称重工作站参数如表1所示。

表1 微量称重工作站测量参数

静力称重测量系统对试验环境有严格要求，具体参数为：工作环境温度（20±1）℃，相对湿度控制30%～60%，工作台面防震、防尘、远离热源，且环境温度1 h变化不大于1℃，检定介质与室温相差不大于2℃。

采用Anton Paar公司的DMA5000 U型管震荡原理密度测量设备来测定液体样品的密度，密度测量分辨率为1×10-6g／cm3。

容积值计算公式为：

式中：V20为标准温度20℃时移液装置的实际容量，m3；m为被检移液装置所排出的蒸馏水表观质量，kg；ρb为砝码密度，取8 000 kg／m3；ρa为检定时实验室内的空气密度，取1.2 kg／m3；ρw：蒸馏水在t℃时的密度，kg／m3，使用Tanaka公式，具体定义为［9，10］：

式中：t为测量介质水的温度，℃；a1＝-3.983 035℃；a2＝301.797℃；a3＝522 528.9℃2；a4＝69.348 81℃；a5＝999.974 950 kg·m-3；β为被检移液装置的体胀系数，取2.4×10-4／℃；t为检定时蒸馏水的温度，℃。

3.2 试验数据分析

使用一个1.0μL移液器进行双波长光度吸收法和静力称重法的试验比对。为了保证测量数据的有效性，分别在中国计量科学研究院和芬兰BIOHIT校准实验室对这个移液器分别进行静力称重法测量（测量结果分别用HW_NIM和HW_BIOHIT表示），然后用DWP方法再进行测量。数据比较如图2和表2所示。

图2 1.0μL DWP方法和HM方法试验数据比较

表2 1.0μL测量点量值偏差与重复性标准偏差 （%）

计算出量值偏差E与重复性标准偏差S：

根据表2中的数据比较分析：对于1.0μL测量点，静力称重法测量结果HW_NIM和HW_BIOHIT数据一致，可以认为作为参考值的静力称重法测量值有效；DWP方法测量系统的测量值大于静力称重法的测量值，测量偏差E为6.08%；就测量重复性而言，光度吸收法测量系统测量重复性S为1.31%，与静力称重法测量系统测量重复性接近。

同样使用一个5.0μL移液器进行光度吸收法和静力称重法的试验比对，数据比较如图3所示。

量值偏差E与重复性标准偏差S数据如表3所示。

表3 5.0μL测量点量值偏差与重复性标准偏差（%）

图3 5.0μL光度吸收法和静力称重法试验数据

根据图中的数据比较分析，对于5.0μL测量点，DWP方法测量系统的测量值大于静力称重法的测量值，测量偏差E为1.42%，而静力称重法的测量偏差一般小于1.00%；就测量重复性而言，DWP方法测量系统测量重复性S为0.22%，与静力称重法测量系统重复性接近。

从1.0μL和5.0μL测量数据分析，DWP方法与静力称重法测量结果基本一致，但测量值偏大，原因之一在于DWP方法有效减少了液体蒸发。

5 结 论

基于Lambert-Beer定律，研究了520 nm和730 nm双波长超微液体容量光度吸收测量法（DWP方法），通过稀溶液浓度与吸光度之间的线性关系可以计算出待测超微量液体容积。

设计了DWP非静力称重方法的测量系统，以ISO 8655为技术参考依据，采用与静力称重测量系统比对试验的方式对这两种方法进行了验证，1μL和5μL试验数据表明：DWP测量方法和静力称重法测量结果具有良好的一致性，均符合ISO 8655的技术要求，但测量值偏大，原因在于DWP测量方法能有效减少液体蒸发。

DWP方法为微小液体容量计量提供了一种较好的解决方案，与HW方法相比，对测量环境要求低，易于实现在线测量，而且可以有效减少液体蒸发对测量结果的影响。

致谢：本研究中与芬兰BIOHIT校准实验室（卡亚里）、芬兰BIOHIT校准实验室（赫尔辛基）、BIOHIT移液装置校准实验室（苏州）和贵州省计量测试院进行了有效合作，他们在技术方案论证和试验条件保障方面做出了卓越的贡献。

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Study on Dual-wavelength Photometric Method for Ultra Micro Liquid Volume Measurement

WANG Jin-tao1， CHEN Chou-yun1，2， LIZhi-hao1， TONG Lin1，LIU Zi-yong1， ZHANG Long1， LUO Zhi-dong3
（1.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China；2.China Jiliang University，Hangzhou，Zhejiang 310018，China；3.Guizhou Institute of Metrology，Guiyang，Guizhou 550003，China）

In order to overcome the shortcoming of significant influence of evaporation capacity on hydro-weighting method，a dual-wavelength photometric method based on Lambert-Beer law at 520 nm and 730 nm was introduced.Micro liquid volume to be measured can be calculated through the linear relation between dilute solution concentration and absorbance.Comparing with the gravimetric method，experimental systems for dual-wavelength photometric method is designed.The test data at1μL and 5μL indicates that dual-wavelength photometric method is in good conformance with gravimetric method，and meet the technical requirement of ISO 8655，but the measured value of dual-wavelength photometric method is a little bigger.dual-wavelength photometricmethod is able to provide a good solution formicro liquid volumemeasurement.By comparing with gravimetricmethod，dual-wavelength photometricmethod is low in requirement of measurement environment，and easy to realize the online calibration and capable of effectively reducing the influence of liquid evaporation.

Metrology；Ultra-micro liquid；Volume；Comparison experiment；Dual-wavelength photometric method

TB938.3

：A

：1000-1158（2015）03-0256-04

10.3969／j.issn.1000-1158.2015.03.08

2013-09-26；

：2014-01-07

国家自然科学基金（51105347，51475440）；质检公益性行业科研专项基金（AHY0711）

王金涛（1976-），男，山东临沂人，中国计量科学研究院副研究员，主要从事容量计量方面的工作。wangjt＠nim.ac.cn